Karakterizacija, racionalni dizajn i primena visokoefikasne α-amilaze iz Bacillus licheniformis za hidrolizu sirovog skroba
Characterization, rational design and application of highly efficent raw starch degrading α-amylase from Bacillus licheniformis.
Докторанд
Šokarda Slavić, MarinelaМентор
Vujčić, ZoranЧланови комисије
Božić, NatašaGavrović-Jankulović, Marija
Метаподаци
Приказ свих података о дисертацијиСажетак
Složeni ugljeni hidrati kao što je skrob, od velikog su industrijskog značaja kako u
oblastima bioenergije i bioprocesovanja, tako i u ljudskoj ishrani. Enzimi koji mogu direktno
da hidrolizuju sirovi (nativni, granularni) skrob na temperaturama nižim od temperature
geliranja privlače sve veći interes jer bi njihovom upotrebom mogao da se smanji utrošak
velike količine energije u zagrevanju skroba prilikom geliranja, a time i pojeftini proces.
Rekombinantna α-amilaza iz Bacillus licheniformis ATCC 9945a (BliAmy), efikasna u
hidrolizi granularnog skroba ispod temperature geliranja, proizvedena je ekstracelularno
korišćenjem Escherichia coli kao domaćina. Razvijeni su efikasni i reproduktivni procesi
fermentacije sa ćelijama E. coli BL21 (DE3) i E. coli C43 (DE3) kroz dizajn medijuma za
rast mikroorganizma i optimizaciju koraka u proizvodnji amilaze. Dobijene su velike količine
BliAmy i to, u fermentaciji sa ćelijama E. coli BL21 (DE3) ukupna amilazna aktivnost od
250,5 IU mL-1 (0,7 g L-...1 ), a sa ćelijama E. coli C43 (DE3) 500 IU mL−1 (1,2 g L−1).
Primenjen je eksperimentalni dizajn u optimizaciji hidrolize skroba, prečišćavanju
proteina i dobijanja bioetanola. Korišćenjem statističke metode odgovornih površina
optimizovan je proces hidrolize koncentrovane suspenzije sirovog kukuruznog skroba.
Pokazano je da je BliAmy veoma efikasna jer je hidrolizovala 91 % prilikom hidrolize 30 % -
ne suspenzije skroba nakon 24 sata.
Na osnovu promena u kristalnoj strukturi analiziranjem rezidualnog skroba koji
zaostaje nakon hidrolize 30%-ne susupenzije nakon 5 i 24 sata pokazano je da kukuruzni
skrob ima A-tip i Vh-tip kristaliniteta. Upoređivanjem difrakcionih intenziteta pikova
kristalne strukture i SEM mikrografije nativnog i rezidualnog skroba može se zaključiti da se
istom brzinom hidrolizuju i kristalni i amorfni regione u granulama skroba, što je u skladu sa
načinom hidrolize skrobnih granula tzv. „granula po granula“...
Complex carbohydrates such as starch are of great industrial interest, especially in
the areas of bioenergy and bioprocessing and increasingly in human nutrition. The
importance of enzymes capable of direct hydrolysis of raw (native, granular) starch below
the temperature of gelatinization has been well recognized due to the energy savings and
the effective utilization of biomass, which reduces the overall cost of starch processing.
Recombinant α-amylase from Bacillus licheniformis ATCC 9945a (BliAmy), highly
efficient in raw starch hzdrolysis was produced extracellularly in Escherichia coli. An
efficient and reproducible fermentation approach was developed with cells E. coli BL21
(DE3) and E. coli C43 (DE3) through the smart design of defined growth medium and
optimization of process steps. Significant overexpression of BliAmy was achieved. Using
E. coli BL21 (DE3) total of 250.5 IU mL-1 (0.7 g L-1 ) was obtained while using E. coli
C43 (DE3) total of 500 IU mL−1 (1.2 g L−1) was achiv...ed.
Experimental design was applied to optimize the hydrolysis of starch, protein
purification and production of bioethanol. The hydrolysis of concentrated raw starch was
optimized using response surface methodology. BliAmy was very effective, achieving the
final hydrolysis degree of 91 % for the hydrolysis of 30 % starch suspension after 24 h.
Cystalline structure of starch residues analysed by X-ray diffraction on the samples
originating from 30 % starch suspensions after 5 and 24 h shown A-type and a Vh-type
crystallinity of corn starch. Constant diffracted intensities and scattering background
indicated that BliAmy most likely degraded both amorphous and crystalline areas at the
same
rates. This is in agreement with a granule by granule mode of attack and can be concluded
from the SEM micrographies...