Biomarkeri inflamacije i ekstracelularne vezikule kao prediktori venske tromboembolije kod pacijenata sa limfomom

Abstract

Limfomi predstavljaju vrlo heterogenu grupu neoplazmi, čija se biološka raznolikost ogleda u različitim mehanizmima napredovanja bolesti i razvoja komplikacija. Jedna od komplikacija koja izaziva značajan morbiditet i mortalitet kod pacijenata sa malignitetima je venska tromboembolija (VTE). Pacijenti sa malignitetom imaju do 7 puta veći rizik za razvoj tromboze u odnosu na opštu populaciju. Specifična patofiziološka karakteristika limfoma je imunološka disregulacija, koja je usko povezana sa aktivacijom inflamacije. Klasični indikatori nivoa inflamacije su broj leukocita i standardizovani reaktanti akutne faze: C-reaktivni protein (CRP), brzina sedimentacije eritrocita (ESR) i fibrinogen. Međutim, danas postoji značajan broj novih markera sistemske inflamacije poput odnosa neutrofila i limfocita (neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR) i odnosa trombocita i limfocita (platelet-to-lymphocyte ratio, PLR). Ekstracelularne vezikule (EV) predstavljaju generički termin za formacije koje se prirodno oslobađaju iz ćelije, koje su ograničene lipidnim dvoslojem i koje se ne mogu replicirati (tj. ne sadrže funkcionalno jedro). EV imaju vrlo sofisticiranu ulogu u brojnim fiziološkim i patološkim procesima, gde se EV otpuštaju od strane različitih ćelija. Uloga EV u trombozi povezanoj sa tumorom (cancer-associated thrombosis, CAT) ispitivana je u animalnim modelima i kod ljudi. Pored toga, EV su povezane sa stanjima kako akutne tako i hronične inflamacije, a često su i „nosači“ različitih molekula od kojih pojedini imaju protrombotički potencijal. S obzirom na sve navedeno, ciljevi istraživanja bili su ispitivanje povezanosti biomarkera inflamacije i razvoja VTE kod pacijenata sa limfomom koji su lečeni (imuno)hemioterapijom, ispitivanje povezanosti VTE sa tipom terapijskog lečenja i odgovora na terapiju kod pacijenata sa limfomom. Sledeći cilj je bio karakterizacija profila EV kod pacijenata sa difuznim B- krupnoćelijskim limfomom (DBKL), ispitivanje povezanosti EV sa VTE kod pacijenata sa DBKL, ispitivanje testa ukupnog hemostaznog potencijala (overall hemostasis potential, OHP) i povezanosti sa VTE kod pacijenata sa DBKL. Metodologija: U prvom delu istraživanja sprovedena je retrospektivna kohortna studija, u koju je uključeno 706 novodijagnostikovanih i relapsirajućih pacijenata sa limfomom koji su lečeni u Klinici za hematologiju, Univerzitetskog kliničkog centra Srbije. Prikupljeni su podaci o svim VTE kod pacijenata sa novodijagnostikovanim limfomom ili relapsom bolesti. NLR i PLR su računati korišćenjem parametara kompletne krvne slike sa diferencijalnom leukocitarnom formulom. Analizirani su sledeći biohemijski parametri: ESR, CRP, laktat dehidrogenaza (LDH), fibrinogen, ukupni proteini (TP), albumin. Drugi deo istraživanja predstavlja prospektivnu kohortnu studiju, koja je uključila 62 pacijenta sa dijagnozom DBKL i sprovedeno je u kolaboraciji sa Univerzitetskom bolnicom Karolinska, Služba koagulacije i kliničke hemije, Odeljenje za molekularnu medicinu i hirurgiju, Institut Karolinska i klinička hemija, medicinska dijagnostika Karolinska. Ispitivanje EV je sprovedeno korišćenjem protočne citometrije. Korišćen je sledeći panel markera: Annexin V za fosfatidilserin (PS), CD42b/CD61 za EV porekla trombocita (platelet-derived extracellular vesicles, PEV), CD142 za tkivni faktor (TF), CD19, CD20 i CD45 za DBKL/B-ćelijsku populaciju, CD62P/CD62E za P-selektin odnosno E-selektin. Za identifikaciju EV korišćen je specifičan gejting algoritam. EV su definisane kao vezikule veličine ≤1,0 μm i pozitivne na Annexin V. Za poređenje EV kod pacijenata sa DBKL, formirana je kontrolna grupa od 5 zdravih volontera...

Lymphomas represent a very heterogeneous group of neoplasms, whose biological diversity is reflected by different mechanisms of disease progression and development of complications. One of the complications that causes significant morbidity and mortality in patients with malignancies is venous thromboembolism (VTE). Patients with malignancy have up to 7-times higher risk of developing thrombosis compared to the general population. A specific pathophysiological characteristic of lymphoma is immune dysregulation, which is closely related to the activation of inflammation. Inflammation has been classically assessed by white blood cell (WBC) count and standardized acute phase reactants including C-reactive protein (CRP), erythrocyte sedimentation rate (ESR), and fibrinogen level. However, today there are a significant number of new markers of systemic inflammation such as neutrophil-to-lymphocyte ratio (NLR) and platelet-to- lymphocyte ratio (PLR). Extracellular vesicles (EVs) are a generic term for formations that are naturally released from cells. They are composed of a lipid bilayer and cannot replicate (i.e., do not contain a functional nucleus). EVs have a very sophisticated role in numerous physiological and pathological processes, where EVs are released by various cells. The role of EVs in cancer-associated thrombosis (CAT) has been investigated in both animal models and in humans. In addition, EVs are associated with conditions of both acute and chronic inflammation, and are often "carriers" of various molecules which possess prothrombotic potential. In view of all the above, the research aims were to examine the association between the biomarkers of inflammation and the development of VTE in patients with lymphoma treated with (immuno)chemotherapy, to examine the association between VTE development with the type of therapeutic treatment and response to therapy in patients with lymphoma. The next objective was to characterize the profile of EVs in patients with diffuse large B- cell lymphoma (DLBCL), to examine the association of EVs with VTE in patients with DLBCL, to examine the overall hemostasis potential (OHP) test and the association with VTE in patients with DLBCL. Methodology: In the first part of the research, a retrospective cohort study was conducted, which included 706 newly diagnosed and relapsed patients with lymphoma, who were treated at Clinic for Hematology, University Clinical Center of Serbia. Data were collected for all VTE events in patients with newly diagnosed lymphoma or relapsed disease. NLR and PLR were calculated using parameters of complete blood count with differential leukocyte formula. The following biochemical parameters were analyzed: ESR, CRP, lactate dehydrogenase (LDH), fibrinogen, total proteins (TP), albumin. The second part of the research was the prospective cohort study, which included 62 patients diagnosed with DLBCL, and was conducted in collaboration with Karolinska University Hospital, Coagulation and Clinical Chemistry Service, Department of Molecular Medicine and Surgery, Karolinska Institute and Clinical Chemistry, Karolinska Medical Diagnostics. The EVs assay was performed using flow cytometry. The following panel of markers was used: Annexin V for phosphatidylserine (PS), CD42b/CD61 for platelet-derived extracellular vesicles (PEVs), CD142 for tissue factor (TF), CD19, CD20 and CD45 for DLBCL/B-cell population, CD62P/CD62E for P- selectin or E-selectin. A specific gating algorithm was used to identify EVs. EVs were defined as vesicles ≤1.0 μm in size and positive for Annexin V. To compare EVs in DLBCL patients, a control group of 5 healthy volunteers was formed...