Повезаност полиморфизама гена за цитокине и локалног имунског одговора са факторима ризика у настанку периимплантитиса

Abstract

Uvod. Identifikacija gena asociranih sa podložnošću čestim poligenetičkim i multifaktorijalnim bolestima predstavlja prioritet biomedicinskih istraživanja. Periimplantitis označava patoške promene koje zahvataju tkiva oko implantata i rezultuje gubitkom potporne kosti. Osim poznate uloge etioloških faktora, bakterijskih infekcija i biomehaničkih faktora, novija istraživanja ukazuju i na genetičku osnovu sklonosti ka periimplantitisu. Pod genetičkim polimorfizmom podrazumevamo alelsku varijantu koja postoji stabilno u populaciji u učestalosti koja je dovoljno velika da se ne smatra samo proizvodom mutacionog procesa i generalno je veća od 1%. U humanom genomu su najzastupljeniji polimorfizmi nukleotidne sekvence (Engl. Single Nucleotide Polymorphism - SNP). Proučavanje polimorfizama gena za citokine i CD14 gena ima važnu ulogu u razumevanju genetičke podložnosti razvoja periimplantitisa s obzirom da geni koji kontrolišu zapaljenski odgovor domaćina imaju važnu ulogu u modulaciji stadijuma periimplantitisa. Nastaje kao rezultat složenog preplitanja genetičkih faktora i faktora spoljašnje sredine. Vezivanje struktura mikroba za receptore epitelnih ćelija pokreće signalne puteve i procese koji se završavaju indukcijom gena neophodnih za produkciju i sekreciju antimikrobnih peptida, slobodnih radikala, leukotriena, prostaglandina, hemokina i citokina IL1, IL6, TNFa. Aktivacija lokalnih rezidentnih ćelija koje prikazuju antigene, antigen prezentujuće ćelije (Engl. Antigene Presenting Cells-APC) u takvom mikrookruženju uz lokalno produkovane slobodne radikale i hemokine uzrokuje produkciju IL6, IL12, IL23, citokina ključnih za aktivaciju i diferencijaciju lokalno aktiviranih T limfocita. Krajnji efektori oštećenja periimplantatnog tkiva su agresivni enzimi, metaloproteinaze čija je lokalna aktivnost regulisana citokinima. Zna se da inflamatorni citokini povećavaju lokalnu sekreciju i aktivnost metaloproteinaza što rezultuje oštećenjem struktura periimplantatnog tkiva i stimulacijom mehanizma resorpcije kosti. Lokalna produkcija antiinflamatornih citokina umanjuje efekte oštećenja periimplantatnog tkiva. Progresijom periimplantitisa koncentracije citokina u periimplantatnoj tečnosti (PICF) se povećavaju, ali postoje individualne razlike u stepenu povećanja produkcije ovih medijatora zapaljenja. U ovom doktorskom radu pošlo se od hipoteze da je prisustvo mutiranih genotipova ispitivanih gena za citokina (TNFa-308, IL1 ra , CD14-159, IL6-174, IL10-1082) udruženo sa povećanim rizikom za nastanak periimplantitisa kod ispitanika sa ugrađenim dentalnim implantatima kao i od toga da je kod ovih ispitanika lokalna produkcija citokina povezana sa mutiranim genotipovima i povećanom sklonošću ka periimplantitisu. Cilj. Cilj ovog istraživanja bio je utvrđivanje učestalosti genotipova i alela polimorfizama gena za citokine, IL6-174 (rs1800795), IL10-1082 (rs1800896), IL1 Ra, TNFa -308 (rsl800629), i CD14-159 (rs2569190), u grupi ispitanika sa razvojem i progresijom periimplantitisa i određivanje povezanosti datih genotipova sa faktorima rizika i sklonosti za razvoj periimplantitisa. Drugi deo istraživanja odnosio se na određivanje lokalne produkcije citokina (IL12, INFy, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, ILip, TNFa, TNFP) u uzorcima tečnosti periimplantatnog sulkusa i utvrđivanje povezanost između detektovanih koncentracija citokina i faktora rizika za sklonost ka periimplantitisu. Na kraju je ispitivano postojanje povezanosti između polimorfizama ispitivanih gena i koncentracije citokina u uzorcima PICF. Materijal i metode. Studijska grupa je obuhvatala 98 ispitanika starosti između 18 i 70 godina sa ugrađenim dentalnim implantatima podeljenih u dve grupe: grupa sa zdravim periimplantatnim tkivom, kao i ona sa dijagnostikovanim periimplantitisom. U studiju su uključeni isključivo implantati koji imaju stabilan protetski rad, tj koji su u funkciji. Kod ispitanika su praćeni i beleženi klinički parametri prisustva ili odsustva zapaljenja tkiva oko implantata. Uzorci uzeti od ispitanika, natopljeni sadržajem periimplantatne tečnosti stavljani su u sterilne epruvete i sadržaj iz papirnog "poena" je izdvojen nakon centrifugiranja uzorka. Određivana je koncentracija citokina ILip, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, IL12, IFNy, TNF-a i TNFp komercijalnim citofluorimetrijskim testom (Bender Medsystems flowcitomix multiplex test kit, BMS 810 FF, SAD). Osim tečnosti iz periimplantatnog sulkusa od svakog ispitanika su uzeti i uzorci periferne krvi za genetičke analize. Izolovana DNK iz krvi se koristila za genotipizaciju analiziranih polimorfizama i to PCR-RFLP metodom u slučaju TNFa, ILlra i CD14 gena, odnosno Real Time PCR metodom za polimorfizme u IL6 i IL10 genima. Dobijeni rezultati su obrađeni statističkim programom SPSS. Povezanosti su smatrane statistički značajnim ukoliko je p vrednost bila manja od 0.05. Rezultati. Zabeležene su značajne razlike u distribuciji genotipova za proučavane polimorfizme CD14-159 (rs2569190) (p<0.0001), IL-6-174 (rs1800795) (p<0.0001), IL- 10 -1082 (rs1800896) (p<0.0001) i TNF- a-308 (rsl800629) (p<0.0001) između grupe sa periimplantitisom i kontrolne grupe. Statistički značajna razlika u distribuciji alela između ispitivanih grupa zabeležena je u slučaju CD14-159 (p=0.003), IL6-174 (p<0.0001) i TNFa-308 (p<0.0001). Nije pronađena statistički značajna veza između analiziranih polimorfizama u CD14, IL-6, IL-10, TNF-a i IL-1ra genima i kliničko patoloških odlika pacijenata. U grupi ispitanika bez periimplantitisa uočeno je postojanje asocijacije između indeksa krvarenja i proučavanog polimorfizma rs2569190 u CD14 genu (p=0.004). Na osnovu analize citokina u periimplantatnoj tečnosti i lokalnog imunskog odgovora došlo se do zaključka da je najmanji gingivalni indeks GI povezan sa visokim koncentracijama IL2, ILip i TNFp. Povećanje vrednosti GI povezana je sa visokim koncentracijama IFNy, IL4 i TNFa, dok su najveće vrednosti GI povezane sa visokim koncentracijama IL10, IL8 i IL5. Odsustvo plaka je povezano sa visokim koncentracijama IL2, IL10, IL6 i TNFp, dok je razvoj plaka povezan sa visokim koncentracijama IFNy, IL8, IL4 i IL5 u periimplantatnoj tečnosti (PCIF). U grupi ispitanika sa implantatima tipa I periimplantitis je povezan sa značajnim porastom IFNy i IL4, dok je u grupi pacijenata sa tipom II implantata periimplantitis povezan sa značajnim porastom vrednosti IL10, IL8, ILip i TNFp. Između medijane koncentracija tri ispitivana citokina TNFa, IL6 i IL10, nije postojala statistička značajnost u zavisnosti od genotipa analiziranih polimorfizama. Zaključak. Analiza polimorfizama gena uključenih u tok i ishod periimplantitisa može dati važne informacije o ovom oboljenju. Između grupe ispitanika sa periimplantitisom i kontrolne grupe sa zdravim tkivom oko implantata uočena je razlika u distribuciji genotipova CD14, IL6, IL10 i TNFa., kao i alela IL6,TNFa i CD14 gena što bi moglo da ukaže na potencijalnu ulogu navedenih polimorfizama u sklonosti ka periimplantitisu. Nije pronađena statistički značajna veza između analiziranih polimorfizama u CD14, IL6, IL10, TNFa i ILlra genima i kliničko patoloških odlika. Multivarijantnom analizom pokazano je da su pol i gingivalni indeks statistički značajni faktori rizika za nastanak periimplantitisa. Kada se analiziraju svi ispitivani citokini (IL12, IFNy, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8, IL10, ILip, TNFa, TNFP) detektovani u uzorcima PICF ispitanika sa različitim tipom implantata u odnosu na periimplantitis, uočljiv je potpuno drugačiji tip lokalnog odgovora na nastalu inflamaciju. Dobijen je i profil imunskog odgovora prema plak indeksu, gingivalnom indeksu i dubini parodontalnog džepa. Analiza lokalnog imunskog odgovora u periimplantatnom tkivu i razjašnjenje genetičke osnove periimplantitisa bi moglo obezbediti bolje razumevanje etiologije bolesti. To bi dovelo do kritičnijeg izbora pacijenata, naročito identifikacije rizičnih pacijenata što bi pospešilo uspeh implantacije. Time bi se stvorio kvalitetniji osnov za jednostavnije lečenje i prevenciju nastanka oboljenja.