Primena klasičnih, molekularno bioloških i imunoenzimskih metoda u izolaciji, detekciji i karakterizaciji bakterija iz roda Listeria

Abstract

Listeria monocytogenes, prouzrokovač listerioze kod ljudi i životinja, je fakultativni intraćelijski mikroorganizam široko rasprostranjen u različitim staništima kao što su zemljište, voda, vegetacija, zagađene vode, stočna hrana i farme. U cilju izolacije i detekcije L. monocytogenes iz hrane koriste se klasične mikrobiološke i nove imunološke i molekularno – biološke metode. S obzirom da klasične mikrobiološke metode, koje omogućavaju kultivaciju mikroorganizama i identifikaciju do nivoa vrste, zahtevaju intenzivan rad i dug vremenski period (od 5 do 7 dana), cilj ovog rada je bio da se standardizuju molekularno – biološke i imunološke metode za izolaciju, detekciju i karakterizaciju L. monocytogenes. U tu svrhu ispitano je 99 uzoraka. Primenom PCR i Real-time PCR metode pomoću hlyA prajmera, detektovani su sojevi L. monocytogenes, ali i atipični, hemolitični sojevi L. innocua J1-023, pa je imunoenzimska automatizovana mini Vidas metoda pokazala najveću specifičnost pri detekciji L. monocytogenes. S druge strane, osetljivost PCR metode kod identifikacije Listeria sp. i L. monocytogenes je bila visoka, tako da je na eksperimentalno kontaminiranim uzorcima pasterizovanog mleka, nakon perioda predobogaćenja inkubacijom od 24 h na 37°C i korišćenjem prajmera specifičnih za hlyA gen, bilo moguće detektovati 1 CFU/ml. Dalji rad se odnosio na ispitivanje potencijalnih izvora populacije bakterija Listeria u kuhinji restorana i industrijskom objektu za proizvodnju tradicionalne fermentisane suve kobasice. Dobijeni rezultati su pokazali da potencijane izvore kontaminacije bakterijama iz roda Listeria u restoranu, predstavljaju prijemne prostorije kao i prostorije za skladištenje sirovina i pripremu hrane. Mesta najčešće kontaminacije su bili podovi i slivnici u samom okruženju restorana. Rezultati detekcije vrsta iz roda Listeria u toku proizvodnje tradicionalne fermentisane suve kobasice su potvrdili da životinje, zaposleno osoblje i sastojci nadeva predstavljaju potencijalne izvore kontaminacije bakterijama iz roda Listeria. Na osnovu dobijenih rezultata potvrđeno je i da temperatura, pH, aktivnost vode, koncentracija hlorida i starter kulture značajno utiču na preživljavanje i razmnožavanje L. monocytogenes u toku proizvodnje tradicionalne fermentisane suve kobasice. Osim toga, ispitivan je i uticaj temperature i vlažnosti suvomesnatih proizvoda na transfer L. monocytogenes u toku narezivanja...

Listeria monocytogenes, the causative agent of listeriosis of humans and animals, is facultative intracellular microorganism widely distributed throughout different habitats, such as soil, water, vegetation, waste waters, feed and farms. Classical microbiological methods and the novel immunology and molecular biology methods are currently used for the isolation and detection of L. monocytogenes in food samples. Taking into consideration the fact that the classical microbiological methods, allowing cultivation of microorganisms and identification to the species level, require intensive and time-consuming work (from 5 – 7 days), the aim of this study has been to standardize molecular biology and immunology methods for the isolation, detection and characterization of L. monocytogenes. For that purpose, 99 samples have been tested. Using PCR and Real time with hlyA primers, both strains of L. monocytogenes and atypical, hemolytic strains of L. innocua J1-023 have been detected, and thus the automated immunoenzymatic assay mini Vidas have showed the highest particularity of detection of L. monocytogenes. On the other hand, sensitivity of detection of Listeria sp. and L. monocytogenes has been high using PCR primers complementary to the hlyA gene. It has been possible to detect 1 CFU/ml of L. monocytogenes in artificially contaminated milk samples after 24 h of incubation at 37°C. Further work has been related to a search of potential sources of Listeria population in the restaurant kitchen and industrial facility for production of traditional, fermented dry sausage. The results obtained have showed that the potential sources of Listeria population in the restaurant are goods reception area, as well as the raw material storage and food processing area. Listeria sp. has been most commonly isolated from the drains and floors in the environment of the restaurant. Analysis of the production of traditional, fermented sausage have confirmed that animals, staff and ingredients are potential sources of Listeria population. Furthermore, the temperature, water activity, chloride concentration and starter cultures have affected the survival and reproduction of L. monocytogenes during the production of traditional, fermented dry sausage. Finally, we investigated the impact of product temperature and moisture on quantitative transfer of L. monocytogenes during commercial slicing of deli ham..