Uloga autofagije u antileukemijskom dejstvu citarabina i idarubicina in vitro
The role of autophagy in the in vitro antileukemic effect of cytarabine and idarubicin
Doktorand
Bošnjak, Mihajlo N.Mentor
Bumbaširević, VladimirČlanovi komisije
Harhaji Trajković, LjubicaIsaković, Aleksandra
Tovilović Kovačević, Gordana
Baskić, Dejan
Metapodaci
Prikaz svih podataka o disertacijiSažetak
Autofagija, proces programirane ćelijske razgradnje unutarćelijskog sadržaja, je
uključena u regulaciju preživljavanja i smrti ćelija kancera. U ovoj doktorskoj disertaciji
je po prvi put ispitivana sposobnost antileukemijskih lekova citarabina i idarubicina da
indukuju autofagiju u različitim humanim leukemijskim ćelijskim linijama i
mononuklearnim ćelijama periferne krvi (MNPK) pacijenata obolelih od leukemije in
vitro. Takođe, ispitivani su unutarćelijski mehanizmi odgovorni za indukciju autofagije,
kao i uloga autofagije u citotoksičnosti ovih lekova.
Vijabilitet REH, HL-60, K562 leukemijskih ćelijskih linija, MNPK pacijenata
obolelih od leukemije i MNPK zdravih kontrola je određivan merenjem aktivnosti
kisele fosfataze i mitohondrijalnih dehidrogenaza. Protočna citofluorimetrija je
korišćena za detekciju apoptoze i zakišeljavanja citoplazme. Indukcija autofagije je
ispitivana fluorescentnom mikroskopijom (detekcija unutarćelijskih kiselih vezikula
obojenih akridin oranžom), transm...isionom elektronskom mikroskopijom (posmatranje
autofagnih vezikula) i imunoblot analizom (konverzija LC3-I u LC3-II, degradacija
SQSTM1/p62). Aktivacija signalnih puteva koji učestvuju u regulaciji autofagije je
analizirana imunoblot metodom. Uloga autofagije u citotoksičnosti citarabina i
idarubicina je ispitivana primenom farmakološke inhibicije bafilomicinom A1,
hlorokinom, vortmaninom i amonijum hloridom, kao i genetske inaktivacije ekspresije
beklina-1, LC3β i SQSTM1 transfekcijom odgovarajućim malim interferirajućim RNK.
Citarabin i idarubicin su izazvali povećanje unutarćelijske kiselosti i pojavu
autofagnih vezikula sa delimično razgrađenim ćelijskim sadržajem u leukemijskim
ćelijskim linijama. Antileukemijski lekovi su stimulisali razgradnju supstrata autofagije
SQSTM1 i povećali konverziju LC3-I u LC3-II formu asociranu autofagozomima u
odsustvu ili prisustvu inhibitora proteolize, ukazujući tako na povećanje autofagnog
fluksa. Oba leka su smanjila fosforilaciju mTOR kinaze, glavnog negativnog regulatora
autofagije i njegovog supstrata p70S6 kinaze, dok je tretman mTOR aktivatorom
leucinom sprečio indukciju autofagije. Idarubicin je suprimirao aktivnost mTOR
aktivatora...
Autophagy, a process of programmed cellular self-digestion, has been
implicated in regulation of cancer cell survival and death. The present study
investigated for the first time the ability of antileukemic drugs cytarabine and idarubicin
to induce autophagy in different human leukemic cell lines and peripheral blood
mononuclear cells (PBMC) from leukemia patients in vitro. Intracellular mechanisms
responsible for the induction of autophagy, as well as the role of autophagy in
cytotoxicity of these drugs were also investigated.
Cell viability of REH, HL-60, K562 leukemic cell lines, and PBMC from
leukemic patients and healthy controls was determined by measuring the acid
phosphatase and mitochondrial succinate dehydrogenase activity. Flow cytometry was
used for the detection of apoptosis and intracellular acidification. Autophagy induction
was assessed by fluorescent microscopy (detection of acridine orange stained
intracellular acidic vesicles), by transmission electron microscopy (ob...servation of
autophagic vacuoles), as well as by immunoblot analysis of LC3 conversion and
SQSTM1/p62 proteolysis. Activation of autophagy-regulating signaling pathways was
analyzed by immunoblotting. Pharmacological inhibition of autophagy with
bafilomycin A1, chloroquine, wortmannin, and NH4Cl or RNA interference-mediated
knockdown of beclin-1, LC3β and SQSTM1 were used to determine the role of the
autophagy in cytotoxicity of antileukemic drugs.
Cytarabine and idarubicin induced an increase in intracellular acidification and
appearance of autophagic vesicles with partially digested cellular components in
leukemic cell lines. Antileukemic drugs stimulated the degradation of autophagic target
SQSTM1 and enhanced the conversion of LC3-I to autophagosome-associated LC3-II
in the absence or presence of proteolysis inhibitors, thus indicating the increase in
autophagic flux...
Fakultet:
Универзитет у Београду, Медицински факултетDatum odbrane:
21-12-2017Projekti:
- Modulacija signalnih puteva koji kontrolišu intracelularni energetski balans u terapiji tumora i neuro-imuno-endokrinih poremećaja (RS-MESTD-Integrated and Interdisciplinary Research (IIR or III)-41025)
- Uloga autofagije u regulaciji smrti tumorskih ćelija (RS-MESTD-Basic Research (BR or ON)-173053)