Biotehnološki potencijal filamentoznih sojeva cijanobakterija sa područja Vojvodine

Abstract

S obzirom da su cijanobakterije (modrozelene alge) identifikovane kao jedna od najperspektivnijih grupa organizama za izolaciju novih i biološki aktivnih prirodnih produkata, cilj ove teze bio je utvrđivanje biotehnološkog potencijala autohtonih filamentoznih sojeva cijanobakterija izolovanih sa područja Vojvodine koji pripadaju azotofiksirajućim rodovima Nostoc i Anabaena i neazotofiksirajućem rodu Spirulina. Biotehnološki potencijal testiranih sojeva je određen u smislu produkcije biomase, fikobiliproteinskih pigmenata, masnih kiselina, fenolnih jedinjenja, antioksidanata, antibakterijskih i antikancerogenih agenasa. Dobijeni rezultati su pokazali da su produkcija biomase i sadržaj fikobiliproteinskih pigmenata kod svih testiranih sojeva zavisili od primenjenih uslova kultivacije, pri čemu je kod sojeva roda Spirulina produkcija biomase bila jače stimulisana primenom kontinualnog osvetljenja, a kod azotofiksirajućih sojeva rodova Nostoc i Anabaena organskim izvorima ugljenika (glicerolom i glukozom). Kao soj sa najvećim potencijalom za proizvodnju biomase izdvaja se soj Spirulina S1, a za produkciju fikobiliproteina sojevi Spirulina S1, Nostoc 2S1, Anabaena Č2 i Spirulina S2. Određivanjem sadržaja masnih kiselina GC-FID metodom utvrđeno je da su kod svih sojeva najzastupljenije bile palmitinska, palmitoleinska, oleinska i linolna kiselina, pri čemu su sojevi roda Spirulina produkovali i γ-linolensku kiselinu, dok su svi sojevi rodova Nostoc i Anabaena produkovali -linoleinsku kiselinu. Najzastupljenije fenolne komponente testiranih etanolnih ekstrakata određene HPLC-MS/MS metodom bile su hinska kiselina i katehin, pri čemu je najveći sadržaj fenolnih jedinjenja registrovan kod soja Nostoc 2S7B. Hemijskom karakterizacijom ekstrakata kod testiranih sojeva takođe je utvrđen značaj azotnih uslova kultivacije u cilju povećanja produkcije fenolnih jedinjenja, kao i -linoleinske kiseline. Poređenjem rezultata antioksidantne aktivnosti u korišćenim testovima DPPH i FRAP, kao sojevi sa najvećim antioksidantnim potencijalom izdvajaju se Spirulina S1 i Spirulina S2. Antibakterijska aktivnost metanolnih ekstrakata registrovana je kod sojeva Nostoc 2S7B, Nostoc 2S1, Anabaena Č2, Anabaena Č5, Spirulina S1 i Spirulina S2, koji su ispoljili efekat na Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, pri čemu su sojevi Anabaena Č2, Nostoc 2S7B i Nostoc 2S1 delovali na najviše bakterijskih sojeva. Kod svih testiranih sojeva je primenom MTT testa uočena antikancerogena tj. citotoksična aktivnost dimetil sulfoksidnih (DMSO) ekstrakata prema HepG2 ćelijskoj liniji, među kojima su najveću aktivnost ispoljili sojevi Nostoc LC1B i Nostoc 2S7B. Primenom bioeseja Artemia salina, Daphnia magna i Danio rerio konstatovan je mali broj sojeva koji su ispoljili toksičnost na test organizme, dok na ćelijsku liniju RTL-W1 testirani sojevi nisu ispoljili citotoksičnost in vitro, što sa aspekta potencijalne biotehnološke primene sojeva ima veliki značaj. Kao najtoksičniji izdvojili su se sojevi Nostoc LC1B i Nostoc S8 koji su ispoljili toksičnost u sva tri bioeseja. Ispitivanjem toksičnosti in vitro u enzimskim esejima konstatovano je da je manji broj sojeva inhibirao aktivnost enzimaprotein fosfataze 1 (PP1) u odnosu na aktivnost enzima acetilholinesteraze (AChE). Primenom Analitičkog hijerarhijskog procesa u grupnom kontekstu, najveću težinu su dobili kriterijumi antikancerogena ativnost, produkcija biomase i sadržaj fikocijanina, navedenim redom. Konačno, u višekriterijumskom kontekstu najbolje rangiran soj je Spirulina S1, na drugom mestu je soj Spirulina S2, dok je na trećem soj Nostoc LC1B.

Cyanobacteria (blue-green algae) have been identified as one of the most promising groups of organisms for the isolation of new and biologically active natural products, therefore, the aim of this thesis was to determine the biotechnological potential of autochthonous filamentous cyanobacterial strains isolated from Vojvodina region, which belong to the N 2-fixing genera Nostoc and Anabaena and non-N2-fixing genus Spirulina. Biotechnological potential of tested strains was determined using the production of biomass, phycobiliprotein pigments, fatty acids, phenolic co mpounds, antioxidants, antibacterial and anticancer agents. The obtained results showed that the production of biomass and phycobiliprotein pigments, in all tested strains, depended on the cultivationconditions, whereas biomass production was strongly stimulated by continuous light in Spirulina strains, and by organic carbon sources (glycerol and glucose) in N2-fixingstrains. The highest potential for biomass production was shown in Spirulina S1 strain.On the other hand, the highest potential for the production of phycobiliproteins wasshown in strains Spirulina S1, Nostoc 2S1, Anabaena C2 and Spirulina S2. By determination of the content of fatty acids using GC-FID method it was found that in allthe tested strains the most common fatty acids were palmit ic, palmitoleic, oleic andlinoleic acid, whereby the strains of the genus Spirulina produced γ-linolenic acid as well,while all strains of the Nostoc and Anabaena genera produced y-linolenic acid. The most frequent phenolic compounds of tested strains determined by using the HPLC-MS/MSmethod were quinic acid and catechin, with the highest content of phenolic compounds registered in Nostoc strain 2S7B. By chemical characterization of the extracts in the tested strains it was also stated a significance of the nitrogen cultivation conditions in order toincrease the production of phenolic compounds, as well as y-linolenic acid. Comparing the results of the antioxidant activity in the DPPH and FRAP tests, it was shown that strains Spirulina S1 and Spirulina S2 had the highest antioxidant potential. The antibacterial activity of the intracellular methanolic extracts was registered in strains Nostoc 2S7B, Nostoc 2S1, Anabaena C2, Anabaena C5, Spirulina S1 and Spirulina S2, that inhibited the growth of Gram-positive and Gram -negative bacteria. Using MTT test, anti-cancer ie. cytotoxic activity of dimethyl sulfoxide (DMSO) extracts to the HepG2 cell line was detected in all tested strains, however, the highest activity was exhibited in strains Nostoc LC1B and Nostoc 2S7B . In bioassays Artemia salina, Daphnia magna and Danio rerio a small number of strains exhibited toxicity to the test organisms, while in case of cell line RTL-W1 tested strains did not show in vitro cytotoxicity, which is of great importance from the aspect of the potential biotechnological application of thestrains. Nostoc LC1B and Nostoc S8 strains induced toxicity in all three bioassays, and therefore considered as the most toxic strains. By testing in vitro toxicity in enzyme assays, it was found that few strains inhibited the activity of protein phosphatase (PP1) enzyme in relation to acetylcholinesterase enzyme (AChE) activity. Using the Analytical hierarchical process in the group context, the highest weight was given to the criteria of anticancer activity, biomass production, and the phycocyanin content, respectively. Finally, in the multi-criteria context, the best-ranked strain is Spirulina S1, Spirulina strain S2 is on the second place, while Nostoc strain LC1B is the third one.