Оптимизација савремених екстракционих поступака за изоловање апигенина из цвета камилице (Chamomilla recutita L.) и карактеризација биолошке активности добијених екстраката

Abstract

У оквиру ове докторске дисертације изведено је испитивање различитих екстракционих поступака за изоловање апигенина из цвета камилице, као и евалуација биолошке активности добијених екстраката. Полазни биљни материјал сачињавале су две групе латица камилице: ферментисане и неферментисане (нативне). Екстракција ферментисаних цветова је извођена применом ултразвучне екстракције користећи етанол као екстрагенс, а добијени екстракти су се одликовали изузетно високим садржајем апигенина. Оптимизација екстракције је била изведена применом методе одзивне површине. Применом електрон-спин резонанце испитана је антирадикалска активност екстраката. Додатно, фармаколошка вредност добијених екстраката је потврђена и одређивањем њиховог антимикробног и антипролиферативног потенцијала. Нативни цветови камилице су екстраховани применом различитих екстаркционих техника: микроталасне, ултразвучне, Soxhlet екстракције као и екстракције субкритичном водом. Eкстрaкција водом у субкритичном стању се показала супериорнијом у односу на све остале технике у погледу садржаја укупних фенола и флавоноида. У циљу добијања екстраката са максималним садржајем апигенина изведена је оптимизација овог екстракционог процеса. Изоловање чистог апигенина је изведено из екстракта добијеног под оптималним екстракцијом условима (однос дрога:растварач 1:30, брзина мешања 3 Hz, притисак 45 bar, температура 115ºC, време 30 мин, концентрација модификатора 0,001 М) применом поступка колонске хроматографије на стубу полиамида. Хемијски профил као и садржај појединачних полифенолних компонената у екстрактима добијеним на различитим притисцима, температурама и уз присуство модификатора различитих концентрација одређен је применом UHPLCDAD- HESI-MS/MS. У свим анализираним екстрактима детектован је велики број полифенолних компонената, док је апигенин у свима био доминантно једињење. Садржај апигенина у екстракту добијеном под оптималним екстракционим условима је износио 1.700,34 mg/kg. Применом седам различитих тестова извршена је евалуација антиоксидативног и антирадикалског потенцијала екстраката. Антимикробни потенцијал екстраката је одређен за осам различитих микробних линија. in vitro тестовима испитана је способност инхибиције α-амилазе, α-глукозидазе и тирозиназе. Деловањем на раст три хистолошки различите ћелијске линије, испитана је антипролиферативна активност екстраката добијених субкритичном водом. Антимотилитетна активност обе групе екстраката (ферментисаних и неферментисаних цветова) одређена је у in vitro условима.

U okviru ove doktorske disertacije izvedeno je ispitivanje različitih ekstrakcionih postupaka za izolovanje apigenina iz cveta kamilice, kao i evaluacija biološke aktivnosti dobijenih ekstrakata. Polazni biljni materijal sačinjavale su dve grupe latica kamilice: fermentisane i nefermentisane (nativne). Ekstrakcija fermentisanih cvetova je izvođena primenom ultrazvučne ekstrakcije koristeći etanol kao ekstragens, a dobijeni ekstrakti su se odlikovali izuzetno visokim sadržajem apigenina. Optimizacija ekstrakcije je bila izvedena primenom metode odzivne površine. Primenom elektron-spin rezonance ispitana je antiradikalska aktivnost ekstrakata. Dodatno, farmakološka vrednost dobijenih ekstrakata je potvrđena i određivanjem njihovog antimikrobnog i antiproliferativnog potencijala. Nativni cvetovi kamilice su ekstrahovani primenom različitih ekstarkcionih tehnika: mikrotalasne, ultrazvučne, Soxhlet ekstrakcije kao i ekstrakcije subkritičnom vodom. Ekstrakcija vodom u subkritičnom stanju se pokazala superiornijom u odnosu na sve ostale tehnike u pogledu sadržaja ukupnih fenola i flavonoida. U cilju dobijanja ekstrakata sa maksimalnim sadržajem apigenina izvedena je optimizacija ovog ekstrakcionog procesa. Izolovanje čistog apigenina je izvedeno iz ekstrakta dobijenog pod optimalnim ekstrakcijom uslovima (odnos droga:rastvarač 1:30, brzina mešanja 3 Hz, pritisak 45 bar, temperatura 115ºC, vreme 30 min, koncentracija modifikatora 0,001 M) primenom postupka kolonske hromatografije na stubu poliamida. Hemijski profil kao i sadržaj pojedinačnih polifenolnih komponenata u ekstraktima dobijenim na različitim pritiscima, temperaturama i uz prisustvo modifikatora različitih koncentracija određen je primenom UHPLCDAD- HESI-MS/MS. U svim analiziranim ekstraktima detektovan je veliki broj polifenolnih komponenata, dok je apigenin u svima bio dominantno jedinjenje. Sadržaj apigenina u ekstraktu dobijenom pod optimalnim ekstrakcionim uslovima je iznosio 1.700,34 mg/kg. Primenom sedam različitih testova izvršena je evaluacija antioksidativnog i antiradikalskog potencijala ekstrakata. Antimikrobni potencijal ekstrakata je određen za osam različitih mikrobnih linija. in vitro testovima ispitana je sposobnost inhibicije α-amilaze, α-glukozidaze i tirozinaze. Delovanjem na rast tri histološki različite ćelijske linije, ispitana je antiproliferativna aktivnost ekstrakata dobijenih subkritičnom vodom. Antimotilitetna aktivnost obe grupe ekstrakata (fermentisanih i nefermentisanih cvetova) određena je u in vitro uslovima.

In the frame of this thesis different extraction approaches for apigenin isolation from chamomile ligulate flowers were examined and biological activity of obtained extracts was evaluated. Starting plant samples included fermented and nonfermented (native) flowers. Extraction of fermented flowers was performed by using ultrasound-assisted extraction with ethanol. The concentration of apigenin was high in obtained extracts. Optimization of the extraction procedures was performed by response surface methodology. Antiradical activity of observed extracts was examined by electron-spin resonance spectroscopy. Furthermore, pharmacological potential of obtained extracts was confirmed by determining their antimicrobial and antiproliferative activity. Native chamomile flowers were extracted by different extraction techniques: microwave, ultrasound, Soxhlet and subcritical water extraction. Subcritical water extraction showed to be superior in comparison to other applied techniques in respect to total phenols and flavonoids content. Optimization of the subcritical water extraction was directed to maximization of apigenin content. Isolation of pure apigenin from extracts obtained under optimal extraction conditions (sample-tosolvent ratio 1:30, agitation rate 3 Hz, temperature 115ºC, pressure 45 bar, extraction time 30 min) was performed by preparative chromatography. Chemical profiles and content of individual polyphenolic components in extracts obtained at different pressures, temperatures, and with different concentrations of a modifier was determined by UHPLC-DADHESI- MS/MS. In all analyzed extracts the great number of polyphenolic components was detected while apigenin was the dominant compound in all extracts. Content of apigenin in the extract obtained under optimal extraction condition was 1,700.34 mg/kg. Antioxidant and antiradical potential of extracts was evaluated according to different mechanisms. Antimicrobial potential of extracts was determined against eight different microbial strains. Ability of extracts to inhibit α- amylase, α-glucosidase and tyrosinase was determined by in vitro assays. Antiproliferative activity of subcritical water extracts was defined by testing their influence on the growth of three histologically different cell lines. Anti-intestinal motility activity of both group of extracts (native and fermented) was determined by in vivo experiments.