Molekularne osnove otpornosti polarnih insekata na niske temperature

Abstract

Sposobnost insekata da se prilagode različitim ekološkim uslovima je veoma dobro dokumentovana; oni predstavljaju najrasprostranjeniju grupu životinja na planeti, sa vrstama koje naseljavaju različita kopnena i vodena staništa, od tropskih predela do polova. Razumevanje mehanizama koji omogućavaju insektima da prežive ekstremne temperature i zadrže vitalne funkcije tokom dugog perioda dormancije je kao model sistem od interesa za mnoge naučne oblasti. Na osnovu načina na koji preživljavaju temperature ispod 0ºC insekte možemo podeliti u tri grupe: i) insekti koji tolerišu formiranje leda u ekstraćelijskom prostoru,ii) insekti koji ne tolerišu zamrzavanje i moraju da ga izbegnu, a to čine superhlađenjem svojih telesnih tečnosti i iii) insekti koji preživljavaju zahvaljujući gubitku vode kroz permeabilnu kutikulu, što je nazvano krioprotektivna dehidratacija. Zajednička odlika organizama sa različitim mehanizmima adaptacije na niske temperature je setbiohemijskih jedinjenja čija se fiziološka funkcija razlikuje u zavisnosti da li organizam pripada grupi koja toleriše ili ne toleriše zamrzavanje. To su nukleatori kristalizacije leda, krio/anhidroprotektanti i antifriz proteini. Cilj ovih istraživanja je bio ispitivanje molekularne osnove otpornosti na niske temperature dve vrste polarnih kolembola Onychiurus arcticus i Cryptopygus antarcticus kombinujući fiziološki, biohemijski i molekularno biološki pristup. Ispitivane vrste izbegavaju zamrzavanje svojih telesnih tečnosti primenjujući različite strategije preživljavanja. Za antarktičku vrstu C. antarcticus karakteristična je brza promena tačke superhlađenja, kao i njena bimodalna distribucija tokom leta, kada neke jedinke mrznu na višim temperaturama (manje otporne na hladnoću), a druga na nižim (otpornije na hladnoću). Ova bimodalna distribucija tačke superhlađenja je dobro dokumentovana, ali slabo razjašnjena na molekularnom nivou. Druga, arktička vrsta O. arcticus koristi strategiju preživljavanja zimskih temperature koje idu i do -25ºC nazvanu krioprotektivna dehidratacija. Na ovaj način, količina slobodne vode u telu se značajno redukuje, a akumulira se trehaloza koja deluje kao krio/anhidroprotektant. Iako je krioprotektivna dehidratacija opisana i kod drugih vrsta insekata, molekularni mehanizmi koji se nalaze u osnovi ovog fenomena su veoma slabo razjašnjeni. Za karakterizaciju genoma generisano je 16379 EST sekvenci za O. arcticus i 1180 za C. antarcticus. To su ujedno i prvi javno dostupni podaci u bazama podataka o genomima ove dve vrste koji predstavljaju značajnu osnovu za komparativne genomske analize. Činjenica da kod obe analizirane vrste, oko 60% EST sekvenci nije pokazalo statistički značajnu sličnost sa proteinima iz baza podataka ukazuje na specifičan patern genske ekspresije kao adaptivni odgovor ispitivanih vrsta na niske temperature. Sa ciljem da se identifikuju geni uključeni u preživljavanje niskih temperatura konstruisani su mikroereji, za O. arcticus štampanjem 6912 cDNK u duplikatu, a za C. antarcticus štampanjem 672 cDNK u duplikatu.. Analizom sekvenci identifikovanih putem homologije sa dostupnm bazama podataka kod C. antarcticusuočen je jasan trend povećane ekspresije gena koji kodiraju strukturne proteine u grupi koja je otporna na hladnoću. Ove strukturne proteine uglavnom čine kutikularni proteini, što je u skladu sa rezultatima nedavnih istraživanja kod kolembola, da je presvlačenje proces tokom kog se snižava tačka superhlađenja, odnosno da varijacije u tački superhlađenja mogu nastati kao posledica endogenih fizioloških procesa tokom presvlačenja. Kod O. arcticus analizom EST sekvenci i mikroereja identifikovani su potencijalni geni i biohemijski putevi povezani sa krioprotektivnom dehidratacijom, a istakli bi gene uključene u metabolizam ugljenih hidrata, gene za akvaporine, proteine toplotnog stresa, LEA proteine i enzime antioksidativne zaštite.

The ability of insects to adapt to diverse ecological conditions iswell documented; they are the most diverse fauna on earth, with different species occupying arange of terrestrial and aquatic habitats from the tropics to the poles. Understanding the mechanisms by which insects survive such extreme temperatures and retain viability for longperiods in the dormant state is of great interest to many scientific fields. Insects have evolved three main strategies to survive sub-zero temperatures: i) freeze tolerance, ii) freeze avoidance and iii) cryoprotective dehydration. The main biochemical compounds involved in surviving sub-zero temperatures are same for different strategies but their physiological role is different. They include: ice nucleating agents (INAs), cryo/ anhydroprotectants, and antifreeze proteins (AFPs). The aim of this study was to determine molecular adaptations to extreme cold environments, combining physiology, biochemistry and molecular biology pproaches, in thePolar Collembola: Cryptopygus antarcticus and Onychiurus arcticus. Both species are freeze avoiding but employ different strategies for surviving low temperatures. The Antarctic springtail C. antarcticusis capable of rapid cold hardening with a bi-modal distribution of super cooling points (SCP) with high (less cold-hardened) and low (more cold-hardened) groups of animals present even during the growing season in summer. This bimodal distribution has been well documented, but is poorly understood. The Arctic springtail O. arcticusemploys the strategy known as cryoprotective dehydration to survive winter temperatures as low as -25ºC. With this technique, the amount ofavailable water in the body is reduced to almost zero and also there is an accumulation of trehalose, which acts as a cryo/anhydroprotectant. Although cryoprotective dehydration has been described in other insects, the molecular mechanisms behind this phenomenon are poorly understood. A total of 16,379 EST clones were generated for O. arcticus and 1180 for C. antarcticus. This represents the first publicly available sequence data for this two species providing useful data for comparative genomic analysis. The fact that around 60% of the clones for both species showed no sequence similarity to annotated genes in the datasets, suggests a specific pattern of gene expression in these species as adaptation to low temperatures. Two microarrays were constructed to identify genes involved in surviving low temperatures, one for C. antarcticus by printing 672 clones in duplicate and the other for O. arcticus by printing 6912 clones in duplicate. An analysis of those where putative function could be inferred via database homology, in C. antarcticus there was aclear pattern of up-regulation of structural proteins being associated with the cold tolerant group. These structural proteins mainly comprised cuticle proteins and provide support for the recenttheory that summer SCP variation within Collembola species could be a consequence of moulting, with moulting population having lowered SCPs. In O. arcticus EST and microarrayanalysis revealed clones and biochemical pathways associated with cryoprotective dehydration with a particular reference to genes involved in carbohydrate metabolism, aquaporin genes, heat shock proteins, LEA proteins and antioxidant enzymes.