Antioksidativni metabolizam belog i zelenog tkiva listova panaširane muškatle (Pelargonium zonale) i tamjanike (Plectronthus coleoides) - uticaj zračenja iz veidljive i UV-B oblasti

Abstract

Biljke izabrane kao eksperimentalni modeli za ovu disertaciju bile su panaširane muškatle (Pelargonium zonale) i tamjanike (Plectranthus coleoides). Zeleno-belo panaširano lišće predstavljalo je odličan sistem za proučavanje uticaja fotosinteze na antioksidativni i fenolni metabolizam, kao i za istraživanje metaboličkih interakcija između autotrofnog, „izvor“, tkiva, i heterotrofnog, „uvir“, tkiva unutar istog lista. U svom prirodnom staništu biljke su izložene visokom intenzitetu vidljive svetlosti i UV-B zračenju (280-315 nm). Visok intenzitet fotosintetski aktivnog zračenja (PAR, 400-700 nm) može da nadjača kapacitet fotosintetske potrošnje i procese energetskog rasipanja i da prouzrokuje inhibiciju fotosinteze, CO2 asimilacije i pojačanu akumulaciju reaktivnih kiseoničnih vrsta (eng. reactive oxygen species, ROS). Stoga su biljke razvile brojne mehanizme zaštite, koji uključuju i postojanje specijalizovanih enzimskih i neenzimskih antioksidanata. Cilj istraživanja ove teze bio je određivanje konstitutivnih komponenata antioksidativnog sistema i njihove distribucije u fotosintetski aktivnom i fotosintetski neaktivnom tkivu listova panaširanih vrsta. Pri optimalnim svetlosnim uslovima za rast, aktivnosti enzima askorbat-glutationskog (Asc-GSH) ciklusa, kao i Cu/Zn i Mn superoksid-dismutaze su bile veće u belom tkivu, dok su aktivnosti katalaze (CAT) i tilakoidne askorbat-peroksidaze (APX) bile veće u zelenom tkivu listova biljaka P. zonale. Biohemijskim i imunocitohemijskim analizama, pomoću transmisione elektronske mikroskopije, pokazano je da je Asc dvostruko više zastupljen u mezofilnim ćelijama zelenog tkiva (u peroksizomima, mitohondrijama i jedru), a GSH u mezofilnim ćelijama belog tkiva (u mitohondrijama, jedru i citosolu). S obzirom na doprinos fotosinteze u stvaranju reaktivnih kiseoničnih vrsta (eng. reactive oxygen species, ROS), praćen je odgovor enzimskih komponenata Asc-GSH ciklusa, CAT i peroksidaza III klase u belom i zelenom tkivu listova u uslovima stimulisane Melerove reakcije tokom izlaganja biljaka P. zonale visokom intenzitetu PAR-a i tretmanu parakvatom. Ovakav tretman je izazvao izraženiji odgovor enzimskih komponenti Asc-GSH ciklusa belog tkiva, u odnosu na zeleno, što je ukazalo da je belo tkivo dobro adaptirano protiv oksidativnog stresa. iii U drugom delu ove disertacije ispitivani su i specifični uticaji ambijentalnog UV-B zračenja (0.90 W m–2) i visokog intenziteta PAR-a (1350 µmol m–2 s –1) na fotosintetsku aktivnost i parametre izmene gasova (CO2 i H2O), kao i na antioksidativni i fenolni metabolizam panaširanih listova P. coleoides i P. zonale biljaka. Kako bi se izbegli mogući štetni efekti usled neprilagođenog UV-B/UV-A/PAR odnosa, kao i od nerealnih intenziteta i spektralnih karakteristika svih komponenti zračenja, eksperimenti su izvođeni u simulatorima sunčevog zračenja. Pokazano je da je efekat UV-B zračenja bio zavisan od biljne vrste, ali i od intenziteta pozadinskog PAR-a. U biljkama P. coleoides UV-B zračenje je stimulisalo brzinu asimilacije CO2 i provodljivost stoma, dok u biljkama P. zonale, UV-B zračenje nije uticalo na fotosintezu, već je preko trehaloznog signalnog puta dovelo do degradacije skroba i saharoze, i stimulisalo transport ugljenih hidrata iz zelenog u belo tkivo. Kako je u obe ispitivane biljne vrste UV-B zračenje dovelo do pojačane akumulacije glikozida hidroksicinamičnih kiselina i flavonoida (sa antocijanima), uglavnom u belom tkivu listova, predložena su dva mehanizma koji kompenzuju nedostatak fotosinteze i pojačane anaboličke zahteve u ovom tkivu. Visok intenzitet PAR-a je imao veći efekat na listove P. zonale u odnosu na listove P. coleoides biljaka. U biljkama P. zonale je stimulisao biosintezu fenilpropanoida i flavonoida sa orto-dihidroksi-supstituisanim B prstenom, a u sinergiji sa UV-B zračenjem, izazvao je porast aktivnosti APX, CAT i sadržaja Asc isključivo u zelenom tkivu listova biljaka P. zonale. Dobijeni rezultati ukazuju na postojanje različitih aklimatizacionih odgovora na UV-B zračenje u zelenom i belom tkivu biljaka P. zonale.

In this thesis, variegated geranium (Pelargonium zonale) and Swedish ivy (Plectranthus coleoides) were used as model plants. Green-white variegated leaves are an excellent model system for investigating the effects of photosynthesis on antioxidative and phenolic metabolism, and “source”-“sink” interactions within the same leaf. In their natural habitat, plants are exposed to high light intensity and to UV-B radiation (280-315 nm). High levels of photosynthetically active radiation (PAR) however, might exceed the the photosynthetic assimilation capacity and energy dissipation processes and provoke inhibition of photosynthesis and enhanced accumulation of reactive oxygen species (ROS). Therefore, plants have developed numerous protection mechanisms, including specialized enzymatic and non-enzymatic antioxidants. The aim of this study was to determine constitutive components of antioxidative system and their distribution in photosynthetically active and non-active tissues of variegated plants. Under optimal light conditions, activities of ascorbate-glutathione (AscGSH) cycle enzymes, Cu/Zn and Mn superoxide dismutases were higher within white leaf tissue of P. zonale, while thylakoid ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT) activities were higher in green leaf tissue. Biochemical and immunocytochemical analysis using transmission electron microscopy revealed two-fold higher Asc content in mesophyll cells of green leaf tissue (in peroxisomes, mitochondria, nucleus), while GSH was more abundant in mesophyll cells of white leaf tissue (in mitochondria, nucleus, cytosol). Since photosynthesis is the main source of ROS in the leaves, the second aim in this thesis was to analyze the response of Asc-GSH cycle components, CAT and class III peroxidases in green and white leaf tissues, under the conditions of stimulated Mehler reaction during the exposure of P. zonale to high PAR and paraquat. These treatments induced greater response of Asc-GSH cycle enzymes in white leaf tissue, compared with green one, indicative of the development of adaptive mechanisms to avoid oxidative stress. In the second half of this thesis, the specific effects of high PAR (1350 µmol m–2 s –1) and ambient UV-B irradiances (0.90 W m–2) on photosynthetic activity and gas v exchange parameters (CO2 and H2O), as well as on antioxidative and phenolic metabolism of variegated P. coleoides and P. zonale plants were studied. In order to avoid possible detrimental effects caused by unrealistic UV-B/UV-A/PAR ratios, quantity and spectral quality of radiation, the experiments were conducted in unique sun simulators. The results showed that ecologically relevant UV-B radiation-induced responses are species-specific and dependent on background light. Two mechanisms to compensate the absence of photosynthetic activity and increased anabolic demands in white, “sink” tissue were proposed. UV-B radiation stimulated CO2 assimilation rate and stomatal conductance in P. coleoides plants. On the other hand, in P. zonale, UV-B radiation, provoked starch and sucrose degradation via the trehalose signalling pathway, and subsequent sugar transport from green to white tissue, without affecting photosynthesis. UV-B radiation induced enhanced accumulation of hydroxycinnamic acid and flavonoid glycosides, in both variegated species, mostly in white leaf tissue. High PAR had stronger effects on the leaves of P. zonale plants, compared with P. coleoides plants. Additionally, high PAR stimulated specific accumulation of phenylpropanoids and flavonoids with ortho-dihydroxy B-ring substitution pattern, and synergistically with UV-B radiation, increased APX and CAT activities and Asc content, exclusively in green leaf tissue of P. zonale plants. Overall, these results show differential acclimatisation responses to UV-B radiation in green and in white tissue of P. zonale leaves