Racionalni dizajn i sinteza jedinjenja sa strukturnim skeletom amida aroilakrilnih kiselina koja ispoljavaju antiholinesteraznu, antitubulinsku i antiproliferativnu aktivnost

Abstract

U ovoj tezi su opisane različite strukturne modifikacije aroilakrilnih kiselina, zasnovane na relativno jednostavnim sintetičkim procedurama. Biološka aktivnost dobijenih novih jedinjenja (sa oznakama 1a-29a, 1b-38b, 151c, 152c i 156c) je ispitana prema nekoliko bioloških meta relevantnih za maligna oboljenja i Alchajmerovu bolest. Dizajnirana je i sintetizovana kongenerna serija dvadeset i devet amida (E)-4-aril-4-okso-2-butenskih kiselina, u nameri da se ispita njihova antiproliferativna aktivnost i mogući mehanizam dejstva. Antiproliferativna aktivnost je ispitana prema tri ćelijske linije humanih tumora (HeLa, FemX, K562). Jedinjenja su ispoljavala antiproliferativnu aktivnost u niskim mikromolarnim ili submikromolarnim koncentracijama. Najjače dejstvo su pokazala alkil-supstituisana jedinjenja na aroil-delu molekula. Četrnaest jedinjenja je inhibiralo polimerizaciju tubulina u koncentracijama nižim od 20 μM. Jedinjenje sa najvećom jačinom antitubulinskog dejstva je derivat sa nesupstituisanim aroil-fenil- i nesupstituisanim fenilamidnim prstenom, 1a, sa IC50=2,9 μM. Testirana je i akutna toksičnost in vivo, na albino miševima (NMRI Hann). LD50 za fluoro-derivat 23a iznosila je 45 mg/kg. Ovo ukazuje na značajnu toksičnost amida aroilakrilnih kiselina (1a-29a). Analiza ćelijskog ciklusa, urađena na K562 ćelijama, pokazala je da derivati 1a, 2a i 23a izazivaju porast broja ćelija u G2/M fazi, međutim, inhibicija polimerizacije tubulina nije jedini mehanizam dejstva ovih jedinjenja. Uprkos tome, jedinjenja 1a-29a predstavljaju dobre vodeće strukture za dizajn nove klase antitubulinskih agenasa. Amidi aroilakrilnih kiselina su dalje modifikovani Majklovom adicijom odabranih sekundarnih cikličnih amina na aktiviranu dvostruku vezu, u nameri da se dobiju jedinjenja koja bi ispoljavala inhibicionu aktivnost prema enzimima iz grupe holinesteraza. Dizajnirana je i sintetizovana kongenerna serija od trideset i osam 4-aril-4-okso-2-(N-aril/cikloalkil)butanamida. Strukturne varijacije su obuhvatile cikloalkilamino-grupu na položaju C2 butanskog fragmenta, kao i grupu vezanu za amidni azot molekula. Dvanaest jedinjenja, uglavnom piperidinskih i imidazolskih derivata, inhibiralo je acetilholinesterazu (AChE) u niskom mikromolarnom opsegu. Ova jedinjenja nisu bila aktivna prema butirilholinesterazi (BChE). Nekoliko N-metilpiperazinskih derivata je inhibiralo BChE u niskom mikromolarnom ili submikromolarnom opsegu koncentracija. Ova jedinjenja su bila neaktivna prema AChE. Prema tome, priroda cikloalkilamino-grupe na položaju C2 određuje selektivnost prema jednom, odnosno drugom enzimu. Najaktivniji inhibitor AChE ispoljava mešoviti tip inhibicije, što ukazuje na vezivanje i za slobodan enzim i za enzim-supstrat kompleks. Detaljna doking studija, urađena za sedam jedinjenja sa najvećom jačinom inhibicionog dejstva prema AChE, ukazala je na mogućnost formiranja vodonične veze između amidne -NH- grupe inhibitora i –OH grupe bočnog ostatka Tyr 124. Simulacija molekulske dinamike kompleksa AChE sa jedinjenjem (S)-18, duga 5 ns, pokazala je da je ova interakcija tokom vremena najstabilnija. Ovo je verovatno najjača interakcija između inhibitora i enzima. U nameri da se dizajniraju dualni heterodimerni reverzibilni inhibitori AChE, sprovedena je 3D-QSAR studija, zasnovana na deskriptorima koji su nezavisni od međusobnog prostornog svrstavanja molekula, na setu od 110 dualnih reverzibilnih inhibitora AChE. Izvedena su tri modela, koristeći konformacije molekula dobijene na osnovu sledećih kriterijuma: (i) konformacije minimalne energije, (ii) konformacije najsličnije sa konformacijom liganda kokristalisanog sa AChE i (iii) konformacije dobijene dokingom jedinjenja u šupljinu aktivnog mesta AChE. Sva tri modela imala su dobre statističke parametre i prediktivnost, nezavisno od toga koji je tip konformacija upotrebljen. Modeli su ukazali na važnost protonovanog piridinskog azota takrinskog fragmenta jedinjenja za inhibiciono dejstvo prema AChE. Takođe su intearkcije donora i akaceptora vodoničnih veza prepoznate kao veoma važne. Na ovo ukazuje prisustvo varijabli koje su povezane sa protonovanim piridinskim azotom i sa dve amino-grupe linkera. Polja molekulskih interakcija (MIF) izračunata za šupljinu aktivnog mesta AChE upotrebom N1= (piridinski azot) i DRY (hidrofobna) GRID proba omogućili su da se pronađe veza između aminokiselinskih ostataka u aktivnom mestu AChE i varijabli koje imaju visok pozitivan uticaj na modele. Spoljašnja prediktivnost modela je testirana na setu od 40 inhibitora AChE, od kojih je većina bila stukturno nesrodna sa jedinjenjima iz osnovnog seta, na osnovu koga je model izveden. Aktivnost nekih jedinjenja je određena na različitom enzimskom izvoru (mAChE). Nađeno je da spoljašnja prediktivnost modela jako zavisi od konformacija jedinjenja koje su upotebljene za izvođenje modela. Model zasnovan na konformacijama jedinjenja dobijenih dokingom je imao superiornu prediktivnu moć u odnosu na ostala dva modela, što ukazuje na važnost upotrebe konformacija jedinjenja koje su dobijene u odnosu na geometrijska ograničenja vezivnog mesta AChE. Dizajnirano je nekoliko dualnih, heterodimernih inhibitora AChE zasnovanih na strukturi takrina i amida aroilakrilnih kiselina in silico, i njihova aktivnost je procenjena upotrebom modela izvedenog iz konformacija dobijenih dokingom. Tri jedinjenja su sintetisana i eksperimentalno je određena njihova aktivnost. Jedinjenja su aktivna u nanomolarnim koncentracijama, što je u saglasnosti sa aktivnošću procenjenom na osnovu modela.

In this thesis, various structural modifications of benzoylacrylic acid scaffold, achieved through relatively simple synthetic procedures were done. The resulting novel compounds were tested toward biological targets relevant for cancer and Alzheimers disease. We designed and synthesized various aroylacrylic acid amides, aiming to test their antiproliferative activity and to possibly inferr their principal mechanism of action. Antiproliferative activity of twenty-nine (E)-4-aryl-4-oxo-2-butenoic acid amides against three human tumor cell lines (HeLa, FemX, and K562) was tested. Compounds showed antiproliferative activity in one-digit micromolar to submicromolar concentrations. The most potent derivatives toward all cell lines tested, bear alkyl substitutents on the aroyl moiety of the molecules. Fourteen compounds showed tubulin assembly inhibition at concentrations < 20 μM. The most potent inhibitor of tubulin assembly was compound 1a, with unsubstituted aroyl and phenylamido rings, with IC50 = 2.9 μM. Compound 23a had an LD50 in vivo of 45 mg/kg in albino mice (NMRI Hann), as obtained by oral administration. Cell cycle analysis on K562 cells showed that the compounds 1a, 2a and 23a cause accumulation of the cells in G2/M phase, but inhibition of microtubule polymerization is not the principal mode of action of compounds. Nevertheless, they may be useful leads for the design of a new class of antitubulin agents. Further, we modified aroylacrylic acids amides by Michaels addition of suitably chosen secondary cyclic amines on the activated double bond, with aim to obtain compounds which inhibit cholinesterase enzymes. Congeneric set of thirty-eight 4-aryl-4-oxo-2-(N-aryl/cycloalkyl)butyramides has been designed, synthesized and evaluated for acetyl- and butyrylcholinesterase inhibitory activity. Structural variations included cycloalkylamino group attached to C2 position of butanoyl moiety, and the variation of amido moiety of molecules. Twelve compounds, mostly piperidino and imidazolo derivatives, inhibited AChE in low micromolar range, and were inactive toward BChE. Several N-methylpiperazino derivatives showed inhibition of BChE in low micromolar or submicromolar concentrations, and were inactive toward AChE. Therefore, the nature of the cycloalkylamino moiety governs the AChE/BChE selectivity profile of the compounds. The most active AChE inhibitor showed mixed-type inhibition, indicating binding to the free enzyme and to the enzyme-substrate complex. Thorough docking calculations of the seven most potent AChE inhibitors from the set, showed that the hydrogen bond can be formed between amide -NH- moiety of compounds and -OH group of Tyr 124. The 5 ns of productive, unconstrained, molecular dynamic simulation of the AChE-compound (S)-18 complex showed that this interaction is the most persistent. This is, probably, the major anchoring point for the binding. In intention to design dual heterodimeric, reversible, AChE inhibitors, the 3D-QSAR analysis, based on alignment independent descriptors (GRIND-2), was performed on the set of 110 structurally diverse, dual binding AChE reversible inhibitors. Three models were built, based on different conformations. Conformatiomns were generated following criteria: (i) minimum energy conformations, (ii) conformation most similar to the co-crystallized ligand conformation, and (iii) docked conformation. We found that regardless on conformation used, all the three models had good statistics and predictivity. The models revealed the importance of protonated pyridine nitrogen of tacrine moiety for anti AChE activity, and recognized HBA and HBD interactions as highly important for the potency. This was revealed by the variables associated with protonated pyridinum nitrogen, and the two amino groups of the linker. Molecular interaction fields (MIF) calculated with the N1= (pyridinium nitrogen) and the DRY (hydrophobic) GRID probes in the AChE active site, enabled us to establish the relationship between aminoacid residues within AChE active site and the variables having high impact on models. External predictive power of the models was tested on the set of 40 AChE reversible inhibitors, most of them structurally different from the training set. Some of those compounds were tested on the different enzyme source. We found that external predictivity was highly sensitive on conformations used. Model based on docked conformations had superior predictive ability, emphasizing the need for the employment of conformations built by taking into account geometrical restrictions of AChE active site gorge. Several dual, heterodimeric AChE inhibitors, comprising tacrine and aroylacrylic acid amides molecular fragments were designed in silico, and their activity was estimated using model based on docked conformations of compounds. Three compounds were synthesized, and their anti-AChE activity was determined. The experimentally obtained nanomolar anti-AChE activity of compounds appered in a good agreement with the activity estimated from the model.