Биосинтеза гвајанолида код цикорије (Cichorium intybus L.) - uтицај трансформације на продукцију и испитивање активности гермакрен А-синтазе и -оксидазе коришћењем промоторских фузија и утишавања гена

Abstract

Цикорија (Cichorium intybus L.) је традиционално коришћена лековита биљка богата гвајанолидима - биоактивним сесквитерпенским лактонима. У овом истраживању цикорија је трансформисана уз помоћ Agrobacterium rhizogenes, ради евалуације продукције гвајанолида у трансгеним културама коренова и регенерисаним биљкама, и испитивања утицаја флоралне транзиције и експресије бактеријских онкогена на акумулацију ових једињења. A. rhizogenes сој A4M70GUS je успешно трансформисао цикорију, дајући HR културе из којих спонтано регенеришу изданци, а регенеранти цветају in vitro. Код регенерисаних трансгених биљака, гвајанолиди се акумулирају у току флоралне транзиције, што није случај у нетрансформисаним биљкама. Акумулација ових једињења била је посебно изражена у корену трансформаната, што је корелисало са повишеном експресијом RolC гена. Гвајанолиди потичу од заједничког прекурсора - гермакрена А, који настаје дејством гермакрен А синтазе (GAS). У следећем кораку биосинтезе, гермакрен А оксидаза (GAO) у неколико корака преводи гермакрен А до гермакрен А киселине, од које настаје костунолид - прекурсор осталих сесквитерпенских лактона. GAS РНК цикорије је претходно изолована у краћој и дужој форми - CiGASlo (GAS long) и CiGASsh (GAS short). Из BAC библиотеке цикорије је изолован један промотор за GAS long, два промотора за GAS short и један за GAO, који су фузионисани са флуоресцентним репортером GFP. Функционалност и јачина промотора је праћена агроинфилтрацијом на зеленој салати и стабилном котрансформацијом цикорије A4M70GUS сојем са унетим конструктима. Као репортер за котрансформацију је коришћен други флуоресцентни маркер, DsRED. Услед инкомпатибилности коришћених флуоресцентних репортера DsRED и GFP, активност промотора у регенерисаним трансгеним биљкама је детектована RT-PCR и qRT-PCR техникама. Промотори су се одликовали различитом јачином и делимичном ткивном специфичношћу...

Chicory (Cichorium intybus L.) is traditionally used medicinal plant rich in guaianolides - bioactive sesquiterpene lactones. In this research, chicory was transformed with Agrobacterium rhizogenes in order to evaluate the production of guaianolides in transgenic root cultures and regenerated plants, and to explore the influence of floral transition and bacterial oncogene expression on guaianolide accumulation. A. rhizogenes strain A4M70GUS was successfully used for chicory transformation, producing hairy root cultures, which spontaneously regenerated shoots and plants that were flowering in vitro. In transgenic plants, guaianolides were accumulated during floral transition, which was not the case in untransformed plants. Accumulation of these compounds was especially significant in transformed plants' roots, which correlated with the expression of RolC gene. Guaianolides originate from a common precursor - germacrene A, which is synthesized by germacrene A synthase (GAS). In subsequent steps, germacrene A is converted to germacrene A acid in a series of steps catalyzed by germacrene A oxidase (GAO), which is then converted into costunolide - precursor of other sesquiterpene lactones. Two GAS mRNAs have been previously isolated from chicory - CiGASlo (GAS long) and CiGASsh (GAS short). One promoter for GAS long, two for GAS short and one promoter for GAO have been isolated from chicory BAC library, and fused with a fluorescent reporter GFP. Strength and functionality of the promoters were characterized by lettuce agroinfiltration and by cotransformation of chicory by A4M70GUS strain containing the constructs. DsRED, another fluorescent reporter, was used as a marker for cotransformation. Due to incompatibility of DsRED and GFP, promoter activity was detected in regenerated transgenic plants by RT-PCR and qRT-PCR. The promoters were characterized by different strength and partial tissue specificity. GAS long promoter was less tissue specific than GAS short, which was active mainly in chicory roots...