Изолација и функционална карактеризација гена укључених у синтезу карнозинске киселине

Abstract

Карнозинска киселина, фенолни дитерпен, поседује бројне биолошке активности због чега је потенцијално веома значајна за фармацеутску индустрију. Грчка жалфија (Salvia fruticosa Mill.) и рузмарин (Rosmarinus officinalis L.) богати су природни извори овог једињења. Иако је много тога познато у вези структуре и биолошких активности карнозинске киселине, веома мало се не зна о њеном биосинтетском путу у биљкама. Основни циљ дисертације био је изучавање биосинтезе карнозинске киселине на молекуларном нивоу, изолацијом и функционалном карактеризацијом гена укључених у овај процес. У ту сврху, извршена је анализа постојеће цДНК библиотеке жлезданих длака грчке жалфије, што је за резултат имало идентификацију два гена, названих SfCPS и SfKSL, који потенцијално кодирају дитерпен синтазе. Гени кандидати су изоловани и функционално окарактерисани у бактерији Escherichia coli Mig., квасцима (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen) и дувану (Nicotiana benthamiana Domin). Хетеролога екпресија гена SfCPS и SfKSL резултирала је синтезом милтирадиена, што је утврђено GC-MS анализом и 1D и 2D NMR спектроскопијом (1H, 13C, DEPT, COSY H-H, HMQC и HMBC). За проналажење преосталих гена одговорних за биосинтезу карнозинске киселине, обављено је секвенционирање транскриптома грчке жалфије и рузмарина, уз коришћење 454 GS FLX Titanium платформе. На основу резултата фитохемијске анализе LC-PDA-LTQ-Orbitrap FTMS методом, жлездане длаке младих листова благо стресираних биљака генотипа “Кавуси” грчке жалфије и жлездане длаке млађих стадијума развоја комерцијалног генотипа рузмарина (B & T World Seeds) изабране су као биљни материјал за анализу транскриптома...

Carnosic acid is a phenolic diterpene potentially highly significant for the pharmaceutical industry, due to its numerous biological activities. Cretan sage (Salvia fruticosa Mill.) and Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) are rich natural sources of this compound. Although the structure and biological activities of carnosic acid are widely known, its biosynthetic pathway in plants remains unexplored. The main aim of the dissertation was to investigate the carnosic acid biosynthesis at the molecular level, by isolating and functionally characterizing the genes involved in this process. For that purpose, the existing Cretan sage trichome cDNA library has been analyzed, which has resulted in the identification of two putative diterpene synthase genes, named SfCPS and SfKSL. The candidate genes were isolated and functionally characterized in Escherichia coli Mig., yeast (Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E. C. Hansen) and Nicotiana benthamiana Domin. Heterologous expression of SfCPS and SfKSL genes has resulted in the synthesis of miltiradiene, which has been confirmed by GC-MS analysis and 1D and 2D NMR spectroscopy (1H, 13C, DEPT, COSY H-H, HMQC и HMBC). In order to retrieve the remaining genes responsible for the biosynthesis of carnosic acid, the glandular trichomes of Cretan sage and Rosemary have been sequenced using 454 GS FLX Titanium platform. Based on the results of the LC-PDA-LTQ-Orbitrap FTMS phytochemical analysis, glandular trichomes of Cretan sage young leaves (genotype Kavoussi) exposed to mild stress, and glandular trichomes on the Rosemary leaves of the younger developmental stage (commercial genotype B&T World Seeds), were chosen for the transcriptome analysis...