Efekat mimetika superoksid dismutaze na mitohondrijalni i funkcioni status humanih spermatozoida

Abstract

Neplodnost je globalni problem u svetu. Uzroci i frekvenca različitih oblika neplodnosti variraju, a novije studije pokazuju da reaktivne vrste kiseonika (ROS) i azota (RNS), superoksid (O2 •─) i azot oksid (NO) pre svega, igraju važnu ulogu, posebno kod neplodnosti muškaraca. Pokazano je da su mitohondrije ne samo mesto visoke produkcije reaktivnih vrsta, već organele od čijeg funkcionog statusa zavisi, odnosno sa njim pozitivno korelira, fertilizacioni potencijal i kvalitet humanih spermatozoida. Međutim, molekulska osnova delovanja ROS/RNS na funkcionost spermatozoida, posebno na funkcioni status mitohondrija, još uvek je nepoznata. Cilj doktorske disertacije je da se ispitaju efekti modulacije redoks statusa spermatozoida na ključne parametre koji determinišu funkcioni status, odnosno aktivnost mitohondrija, kao i kvalitet spermatozoida, podjednako na molekulskom i strukturnom nivou. Iz tih razloga, redoks status spermatozoida je specifično moduliran pentaazamakrocikličnim Mn(II) mimetikom SOD (engl. superoxide dismutase), M40403, koji selektivno uklanja O2 •─ i indirektno modulira bioraspoloživost NO. U cilju rasvetljavanja signalnih puteva regulacije fertilizacionih procesa, naročito eventualnog uticaja NO na poboljšanje funkcionog statusa mitohondrija i fertilizacionih svojstava spermatozoida, ispitivali su se sledeći parametri: pokretljivost spermatozoida, koncentracija NO elektrohemijski, korišćenjem NO specifične elektrode, kao i korišćenjem fluorescentne probe specifične za NO (Daf2-DA, diamino-fluorescein-2- acetat); lokalizacija produkcije NO u spermatozoidima; endogena produkcija NO praćenjem ekspresije izoformi NOS (engl. NO synthase) – endotelske (eNOS), neuronalne i inducibilne; enzimi ključni za produkciju O2 •─ (NADPH oksidaza) i njegovo uklanjanje (CuZnSOD, engl. cooper zink SOD i MnSOD, engl. manganese SOD); ekspresija enzima odgovornih za uklanjanje H2O2, nastalog aktivnošću SOD i SOD mimetika, katalaze i GSH-Px (engl. glutathione peroxidase); mitohondrijalna dinamika i metabolički status, praćenjem mitohondrijalnog membranskog potencijala (katjonska fluorescentna proba Mitotracker Green FM) i ekspresija kompleksa oksidativne fosforilacije (kompleks I, kompleks III, kompleks IV, citohrom c, citohroma b i ATP sintaza)...

Infertility is a global problem worldwide. The frequency and origin of different forms of infertility vary, but recent studies showed that reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS), first of all, superoxide (O2 •─) and nitric oxide (NO), play an important role, especially in male infertility. It has been shown that mitochondria play essential role in regulation of reactive species production. Moreover, mitochondrial functional status in spermatozoa positively correlates with fertilizing potential and quality of human sperm. However, the molecular basis of ROS/RNS action on sperm functionality, especially on the functional status of sperm mitochondria, is still unknown. The aim of the dissertation was to examine the effects of redox status modulation in human spermatozoa on the key parameters determining functional status (activity) of mitochondria and sperm quality, at the molecular and structural levels. The redox status of the sperm is specifically modulated using pentaazamacrocyclic Mn(II) mimic SOD (eng. superoxide dismutase), M40403, that selectively removes O2 •─ and indirectly modulates the bioavailability of NO. In order to shed more light on the signalling pathways underlying fertilizing processes, particularly possible beneficial effects of NO on mitochondria functional status and sperm fertilizing properties, the following parameters were examined: sperm motility; concentration of NO, electrochemically, using NO specific electrodes, as well as using fluorescent probes specific for NO (Daf2-DA, fluorescein-diamino-2-acetate); localization of NO production in the spermatozoa; endogenous NO production by determining the expression of NOS isoforms (NO synthase) – endothelial (eNOS), neuronal and inducible; enzymes essential for production of O2 •─ (NADPH oxidase) and its removing (CuZnSOD, cooper zinc SOD and MnSOD, manganese SOD); expression of enzymes removing H2O2, generated by activity of SOD and SOD mimic, catalase and glutathione peroxidase (GSH-Px); mitochondrial dynamic and metabolic status, using cationic fluorescent probe Mitotracker Green FM for monitoring mitochondrial membrane potential and finally the expression of complexes of the oxidative phosphorylation (Complex I, Complex III, Complex IV, cytochrome c, cytochrome b and ATP synthase)...