Ispitivanje ramnolipida dobijenih pomoću sojeva Pseudomonas aeruginosa izolovanih iz sredina zagađenih naftom i naftnim derivatima

Abstract

Cilj ove studije je bio da se ispita proizvodnja ramnolipida dobijenih pomoću pet sojeva Pseudomonas aeruginosa, izolovanih iz sredina bogatih ugljovodonicima (zemljišta zagađenog naftom i naftnim derivatima i industrijskog otpada – mineralnog ulja za sečenje metala). Prvi deo istraživanja je bila optimizacija proizvodnje ramnolipida pomoću soja P. aeruginosa NCAIM (P) B 001380, producenta nekoliko mikrobioloških metabolita koji imaju potencijal za industrijsku primenu. Podloge sa različitim sastavom (izvor ugljenika i azota) su testirane kako bi se poboljšala produkciju ramnolipida. Phosphate-limited proteose peptone-ammonium salt (PPAS) podloga sa suncokretovim uljem, kao izvorom ugljenika, i amonijum hloridom i peptonom, kao izvorom azota, značajno je povećala proizvodnju ramnolipida od 0,15 na osnovnoj PPAS (C/N odnos 4,0), na 3,00 g/l, na optimizovanoj PPAS podlozi (C/N odnos 7,7). U nastavku je primenjena statistička analiza Response Surface Methodology za testiranje efekata tri faktora: temperature, koncentracije izvora ugljenika i azota (v/v) u optimizovanoj PPAS podlozi, na proizvodnju ramnolipida. Utvrđeno je da ekološki izolati P. aeruginosa imaju značajan potencijal za poboljšavanje produkcije ramnolipida na različitim tipovima supstrata, uključujući ekonomične, obnovljive izvore kao što su suncokretovo ulje iz friteze i otpadne frakcije tokom rafinisanja suncokretovog ulja. MS analize su pokazale da su izolovani ramnolipidni biosurfaktanti smeše monoramno- mono-lipidnih, mono-ramno-di-lipidnih- i di-ramno-di-lipidnih jedinjenja. “High througout skrining“ ramnolipidnih smeša dobijenih pomoću različitih sojeva P. aeruginosa (NCAIM (P) B 001380, D1, D2, D3, 67) i referentnog kliničkog soja ATCC 27853 na optimizovanoj podlozi urađen je pomoću MALDI-TOF analize. Razlike između ramnolipidnih profila koje su specifične za soj su ukazale na mogućnost da se definiše ramnolipid “fingerprint” analiziranih izolata P. aeruginosa. Detaljna komparativna analiza ramnolipida je urađena kako bi se video efekat uslova kultivacije na soj - specifični “fingerprint”ramnolipida. Ramnolipidi su praćeni pomoću HPLC-ESI MS, što je omogućilo brzu i pouzdanu identifikacije i kvantifikaciju prisutnih struktura. Najveća koncentracija ukupnih ramnolipida od 3,33 g/l dobijena je za soj P. aeruginosa 67, koji je izolovan iz zemljišta zagađenog naftom i sojeve D1 (1,73 g/l) i D2 (1,70 g/l), iz prirodnog mikrobnog konzorcijumima poreklom iz zemljišta zagađenog mazutom, gajenih na suncokretovom ulju, kao izvoru ugljenika...

The aim of present study was to investigate the production of rhamnolipid biosurfactant produced by five strains of Pseudomonas aeruginosa originated from hydrocarbon rich environments (soil polluted with petroleum and petroleum derivates and industrial waste - mineral mettal cutting oil). The first part of the study was optimization of production of rhamnolipids by strain P. aeruginosa NCAIM (P) B 001380, a producer of several microbial methabolites with potential industrial application. With regard to carbon and nitrogen source several media were tested to enhance production of rhamnolipids. Phosphatelimited proteose peptone-ammonium salt (PPAS) medium supplemented with sunflower oil as a source of carbon and mineral ammonium chloride and peptone as a nitrogen source greatly improved rhamnolipid production, from 0.15 on basic PPAS (C/N ratio 4.0), to 3.00 g/l, on optimized PPAS medium (C/N ratio 7.7). Further, the effect of three factors: temperature, concentration of carbon and nitrogen source in optimized PPAS medium on rhamnolipid production was analyzed by Response Surface Methodology. It was found that the environmental isolates of P. aeruginosa had a significant potential for improved production of rhamnolipids on different types of substrates, including cheap, renewable sources like sunflower oil from deep fryer and sunflower oil mill effluent. MS analysis indicated that rhamnolipid preparations were mixtures of mono-rhamno-mono-lipidic, mono-rhamno-di-lipidic- and dirhamno- di-lipidic congeners. High througout screening of rhamnolipid mixtures produced by different environmental P. aeruginosa strains (NCAIM (P) B 001380, D1, D2, D3, 67) and referent clinical strain ATCC 27853 on optimised medium was performed by MALDI-TOF analysis. Observed differences between rhamnolipid profiles indicated a possibility to define rhamnolipid fingerprint of analyzed P. aeruginosa strains. Detailed comparative analysis of rhamnolipids from environmental isolates of P. aeruginosa was undertaken to evaluate strain specific rhamnolipid fingerprints obtained on different growth conditions...