Синтеза и карактеризација генетички кодираних флуоресцентних волтажних индикатора

Abstract

Електричне промене представљају начин комуникације између неурона и чине основу комплексних феномена у понашању као што су перцепција, сензорно- моторна интеграција, учење и памћење. Активност неурона представља колекцију различитих електричних догађаја који варирају како у трајању, тако и у простирању. Праћење електричне активности неурона у свој просторној и временској комплексности подразумева развијање метода које поседују високу темпоралну резолуцију и висок однос сигнала према шуму. Идеални метод би био у стању да прати подпражне и надпражне промене мембранског потенцијала на нивоу појединачне ћелије и са резолуцијом мањом од секунде. Примена оптичких метода за снимање електричне активности мозга представља мање деструктивну алтернативу традиционалним електрофизиолошким методама базираним на примени електрода. Oптичка снимања нуде високу просторну резолуцију омогућујући симултана снимања са различитих локација у оквиру видног поља, од нивоа појединачних ћелија и делова ћелије до нивоа нервних кола која се састоје од стотина, ако не и хиљада неурона. Током вишедеценијског развоја, почевши од раних експеримената базираних на снимању урођених сигнала који се јављају при нервној активност па све до развоја бројних волтажних боја мале молекулске масе, оптичка снимања су омогућила стицање значајнх сазнања о функционисању мозга и неуралној обради података. Ипак, и у најразвијенијој верзији овим методама недостаје просторна/временска резолуција и ћелијска специфичност која би омогућила опширне студије у будним и активним животињама. У овом раду је описан развој синтетичког протеинског конструкта који експримиран у сисарским неуронима показује промену интензитета флуоресценције у одговору на промене у мембранском потенцијалу. Развој оваквих индикатора је део великих напора који се већ дуже време улажу у области оптичког снимања а који су окренути развоју генетички кодираних волтажних индикатора. Главна предност развоја оваквих проба у односу на доступне волтажне боје малих молекулских маса је могућност циљане експресије у специфичним ћелијама која би даље омогућила снимање електричне активности из жељених ћелија. Током последње две деценије напори да се издизајнира оваква проба су се базирали на примени два концепта. Оригинални концепт у дизајну проба се базира на прављењу фузија између природних волтажно-сензитивних домена (ВСД) изолованих из волтажно-сензитивних протеина и једног или пара флуоресццентних протеина...

Electrical events are the mode of communication among neurons that underly all complex behaviors including perception, sensory-motor integration, learning and memory. Neurons exhibit a collection of different transient electrical events that vary in both spatial and temporal domains. To be able to analyze these events we need methods with both high temporal resolution and large signal to noise ratio. The ideal method would be able to detect both subthreshold and suprathreshold level changes in membrane potential, in single cells (or subcellular domains) at submillisecond resolution. Use of light to record brain electrical activity represents a less invasive alternative to classical electrode-based methods and can provide high spatial resolution. Optical methods allow simultaneous recordings from different locations within a field of view, from the level of single cell and cell compartments to the level of neuronal circuits comprising of hundreds, if not thousands neurons simultaneously. Over the last couple of decades, with early experiments using intrinsic signals that arise with neuronal activity all the way to development of numerous small molecule synthetic dyes optical methods provided unique information on brain function and neuronal information processing. However, even in its most advanced form these methods lack the spatial/temporal sensitivity and cell specificity that would allow comprehensive studies of neuronal function. The present studies describe the development of synthetic protein constructs which when expressed in mammalian neurons produce change in fluorescence intensity in response to changes in membrane potential. Development of the indicators presented here is part of a greater efforts in the field of optical imaging to produce geneticallyencoded voltage indicator (GEVI). These probes would allow cell targeted expression and consequently cell type specific recordings of neuronal activity. In the last two decades efforts to produce such probes have employed two major design concepts. In the first approach, indicators are made as a fusions between naturally occurring voltage sensing domains (VSD) derived from voltage-sensitive proteins and fluorescent protein(s)...