Одређивање фармакокинетике метотрексата у експерименталном моделу применом суве капи крви

Abstract

Метотрексат (МТX) је лек који се употребљава у хемотерапији неколико врста малигнитета, попут рака мокраћне бешике, рака дојке, нонхоџкиновог лимфома, остеосаркома, акутне лимфобластне леукемије. За наведене индикације се обично даје у високим дозама. У ниским дозама, МТX се користи као имуносупресив у терапији улцерозног колитиса, Кронове болести, реуматоидног артритиса, анкилозирајућег спондилитиса и псоријазе. Метотрексат подлеже хепатичном и интрацелуларном метаболизму, где се метаболише од стране фолилполиглутамат синтазе у фармаколошки активне полиглутаматне форме метотрексата - MTXPGn, где “n” означава број глутаматних јединица, и он може бити од 2 до 7. Додавањем глутаматних група метотрексату, повећава се величина молекула, заједно са његовим негативним наелектрисањем и тиме се појачава задржавање метотрексата у ћелији. Ово омогућава метотрексату да инхибира дихидрофолат редуктазу, тимидилат синтазу и 5-аминоимидазол 4-карбоксамид рибонуклеотид трансформилазу, што резултује ометањем синтезе ДНК, поправке и ћелијске деобе. Последично, МТX испољава своје цитотоксично дејство на ћелије које се брзо умножавају Метотрексат има мали терапијски индекс и може испољити нежељена и токсична дејства при било ком дозном режиму. Такође, показује значајну фармакокинетичку варијабилност међу пацијентима, али и при понављаној примени код истог пацијента. Како би се повећала ефикасност терапије и смањили токсични ефекти, потребно је направити персонални дозни режим. У првом делу ове студије извршена је валидација LC-MS методе за квантификацију метотрексата и полиглутамата у oпсегу концентрација од 0,25 μg/mL до 30 μg/mL за узорке плазме, ревалидација методе за опсег концентрација метотрексата и полиглутамата од 0,5 μg/mL до 30 μg/mL за узорке крви и валидацију методе за опсег концентрација метотрексата од 0,5 μg/mL до 50 μg/mL за узорке суве капи крви. Раствор метотрексата је апликован пацовима, мушког пола соја Wistar, као болус интравенска инјекција. Пацови су методом случајног избора распоређени у четири дозне групе - 5, 40, 80 и 160 mg/kg. Узорци крви, плазме и суве капи крви су узети у 10., 20., 30., 45., 60., 90., 120., 180., 240., 360. и 480. минуту након примене лека. Узорци крви, плазме и суве капи крви пацова су анализирани валидованом LC-MS методом. Поређење концентрација метотрексата измерених у течним узорцима крви и узорцима суве капи крви помоћу LC-MS методе, je спроведено употребом Бланд-Алтман теста при чему нису утврђене статистички значајне разлике између ове две валидоване методе. У другом делу ове студије извршен је прорачун фармакокинетичких параметара и утврђивање фармакокинетичког модела за постављање индивидуалног режима дозирања. Употребом софтвера PKSolver је спроведена некомпартманска анализа, те су одређени фармакокинетички параметри метотрексата. Постављен је математички модел који описује фармакокинетику метотрексата помоћу двокомпартманског система. Употребом софтвера Wolfram Mathematica спроведена је двокомпартманска анализа и добијени су фармакокинетички параметри. Упоређене су површине испод криве добијене компартманском и некомпартманском анализом и нису примећене статистички значајне разлике међу њима. Постављени математички модел се може екстраполирати на пацијенте оболеле од акутне лимфобластне леукемије и искористити у изради фармакокинетичког модела којим ће се одредити индивидуални режим дозирања лека.

Metotreksat (MTX) je lek koji se upotrebljava u hemoterapiji nekoliko vrsta maligniteta, poput raka mokraćne bešike, raka dojke, nonhodžkinovog limfoma, osteosarkoma, akutne limfoblastne leukemije. Za navedene indikacije se obično daje u visokim dozama. U niskim dozama, MTX se koristi kao imunosupresiv u terapiji ulceroznog kolitisa, Kronove bolesti, reumatoidnog artritisa, ankilozirajućeg spondilitisa i psorijaze. Metotreksat podleže hepatičnom i intracelularnom metabolizmu, gde se metaboliše od strane folilpoliglutamat sintaze u farmakološki aktivne poliglutamatne forme metotreksata - MTXPGn, gde “n” označava broj glutamatnih jedinica, i on može biti od 2 do 7. Dodavanjem glutamatnih grupa metotreksatu, povećava se veličina molekula, zajedno sa njegovim negativnim naelektrisanjem i time se pojačava zadržavanje metotreksata u ćeliji. Ovo omogućava metotreksatu da inhibira dihidrofolat reduktazu, timidilat sintazu i 5-aminoimidazol 4-karboksamid ribonukleotid transformilazu, što rezultuje ometanjem sinteze DNK, popravke i ćelijske deobe. Posledično, MTX ispoljava svoje citotoksično dejstvo na ćelije koje se brzo umnožavaju Metotreksat ima mali terapijski indeks i može ispoljiti neželjena i toksična dejstva pri bilo kom doznom režimu. Takođe, pokazuje značajnu farmakokinetičku varijabilnost među pacijentima, ali i pri ponavljanoj primeni kod istog pacijenta. Kako bi se povećala efikasnost terapije i smanjili toksični efekti, potrebno je napraviti personalni dozni režim. U prvom delu ove studije izvršena je validacija LC-MS metode za kvantifikaciju metotreksata i poliglutamata u opsegu koncentracija od 0,25 μg/mL do 30 μg/mL za uzorke plazme, revalidacija metode za opseg koncentracija metotreksata i poliglutamata od 0,5 μg/mL do 30 μg/mL za uzorke krvi i validaciju metode za opseg koncentracija metotreksata od 0,5 μg/mL do 50 μg/mL za uzorke suve kapi krvi. Rastvor metotreksata je aplikovan pacovima, muškog pola soja Wistar, kao bolus intravenska injekcija. Pacovi su metodom slučajnog izbora raspoređeni u četiri dozne grupe - 5, 40, 80 i 160 mg/kg. Uzorci krvi, plazme i suve kapi krvi su uzeti u 10., 20., 30., 45., 60., 90., 120., 180., 240., 360. i 480. minutu nakon primene leka. Uzorci krvi, plazme i suve kapi krvi pacova su analizirani validovanom LC-MS metodom. Poređenje koncentracija metotreksata izmerenih u tečnim uzorcima krvi i uzorcima suve kapi krvi pomoću LC-MS metode, je sprovedeno upotrebom Bland-Altman testa pri čemu nisu utvrđene statistički značajne razlike između ove dve validovane metode. U drugom delu ove studije izvršen je proračun farmakokinetičkih parametara i utvrđivanje farmakokinetičkog modela za postavljanje individualnog režima doziranja. Upotrebom softvera PKSolver je sprovedena nekompartmanska analiza, te su određeni farmakokinetički parametri metotreksata. Postavljen je matematički model koji opisuje farmakokinetiku metotreksata pomoću dvokompartmanskog sistema. Upotrebom softvera Wolfram Mathematica sprovedena je dvokompartmanska analiza i dobijeni su farmakokinetički parametri. Upoređene su površine ispod krive dobijene kompartmanskom i nekompartmanskom analizom i nisu primećene statistički značajne razlike među njima. Postavljeni matematički model se može ekstrapolirati na pacijente obolele od akutne limfoblastne leukemije i iskoristiti u izradi farmakokinetičkog modela kojim će se odrediti individualni režim doziranja leka.

Methotrexate (MTX) is used in cancer chemotherapy to treat several malignancies such as bladder and breast cancer, non-Hodgkin’s lymphoma, osteosarcoma, and acute lymphoblastic leukemia. For these indications, it is usually administered in high doses. In low doses, MTX is used as an immunosuppressive drug in the treatment of ulcerative colitis, Crohn’s disease, rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis and psoriasis. Methotrexate undergoes hepatic and intracellular metabolism by folylpolyglutamate synthase into pharmacologically active polyglutamated forms of methotrexate - MTXPGn, where “n” denotes the number of glutamate units and it can be from 2 to 7). Glutamate moiety addition to MTX increases the size of the molecule together with its negative charge and enhances the intracellular retention of MTX. This allows MTX inhibition of dihydrofolate reductase, thymidylate synthase, and 5-aminoimidazole 4-carboxamide ribonucleotide transformylase, which results in interfering with DNA synthesis, repair, and cellular replication. Consequently, this leads to the cytotoxic action of MTX against rapidly multiplying cells. Methotrexate has a narrow therapeutic range and it can exert adverse and toxic effects at any dose regime. Also, it possesses significant interindividual pharmacokinetic variability, as well as intraindividual variability. To improve the efficacy of therapy and reduce toxicity, a personalized drug dose regimen is needed. The first part of this study was LC-MS method validation for range of MTX and MTXPGn concentrations, from 0,25 μg/mL to 30 μg/mL in plasma samples, method revalidation for range of MTX and MTXPGn concentrations starting from 0,5 μg/mL to 30 μg/mL in blood samples and method validation for range of MTX concentrations from 0,5 μg/mL to 50 μg/mL for dry blood spot samples. Afterwards, methotrexate solutions were administered to male Wistar rats as bolus intravenous injection. There were four dose groups - 5, 40, 80, and 160 mg/kg, to which rats were randomly assigned. Blood, plasma and dry blood samples were obtained at 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360 and 480 minutes from drug administration. Using the validated LC-MS method rats’ blood, plasma, and dry blood spots were analyzed. Comparison of the methotrexate concentration obtained by blood sample method and dry blood spot method utilizing LC-MS was conducted by Bland-Altman test and no statistically significant differences were noticed between these two validated methods. The second part of this study was to calculate pharmacokinetic parameters and establish the pharmacokinetic model for individual dose regimes. Non- compartmental analysis using PKSolver software was performed, in order to obtain pharmacokinetic parameters of methotrexate. Mathematical model was established for description of two-compartmental methotrexate pharmacokinetic. Using software Wolfram Mathematica, two-compartment analysis has been carried out and pharmacokinetic parameters were attained. Areas under the curve acquired from both compartmental and non-compartmental analysis were compared, and no statistically significant differences were noticed. Established mathematical model can be extrapolated on patients with acute lymphoblastic leukemia and used for establishing pharmacokinetic model for individualizing drug dosage regimens.