Analiza nivoa ekspresije i varijanti gena SMAD7 u kolorektalnom karcinomu

Abstract

Inhibitorni SMAD7 ima ključnu regulatornu ulogu u TGF-β signalizaciji posredovanoj SMAD proteinima, koja je često narušena u kolorektalnom karcinomu (CRC). U ovoj studiji je analizirana ekspresija SMAD7 gena i njegov balans sa zajedničkim medijatorom SMAD4 genom u progresiji primarnog i metastatskog CRC i predikciji terapijskog odgovora, kao i genetička varijabilnost 3’ netranslatirajućeg regiona (3’UTR) SMAD7 i funkcionalne posledice otkrivenih varijanti. Ekspresija i odnos SMAD7 i SMAD4 ispitivani su metodom kvantitativni PCR u realnom vremenu (qRT-PCR) u tumorskim i uparenim netumorskim tkivima primarnih i metastatskih CRC ispitanika, sedam humanih ćelijskih linija i SW620 ćelijama tretiranim hemioterapeuticima. 3’UTR SMAD7 je analiziran direktnim sekvenciranjem, relativnom kvantifikacijom diferencijalne alelske ekspresije otkrivenih varijanti metodom alel-specifični qRT-PCR, kao i in silico predikcijom njihovih regulatornih posledica. Rezultati su pokazali promenu odnosa SMAD7/SMAD4 u tumorima i odgovoru na terapiju, povišenu SMAD7 ekspresiju u tumorima ispitanika sa dobrim u odnosu na one sa lošim odgovorom na neoadjuvantnu hemioradioterapiju (nCRT) i četiri različite varijante pojedinačnog nukleotida (SNV) u 3’UTR-u koje su ispoljavale alelsku neravnotežu i modifikovale mesta vezivanja mikroRNK (miRNK), od kojih je jedna prvi put detektovana somatska varijanta. Izmenjen odnos SMAD7/SMAD4 u tumorskim ćelijama i tkivima ukazuje na značaj narušavanja ovog balansa u progresiji tumorske bolesti. Diferencijalnu ekspresiju SMAD7 u odgovoru na nCRT treba dalje istražiti zbog moguće prediktivne vrednosti. Alelska neravnoteža u ekspresiji detektovanih SNV koje menjaju vezivanje miRNK ukazuje na njihovu potencijalno važnu ulogu u regulaciju ekspresije SMAD7 u CRC.

Inhibitory SMAD7 plays a crucial regulatory role in SMAD-dependent TGF-β signaling that is often disrupted in colorectal cancer (CRC). This study aimed to analyze the expression of SMAD7 and its balance with common mediator SMAD4 in primary and metastatic CRC progression and prediction, as well as genetic variation in SMAD7 3′ untranslated region (3′UTR) and its functional consequences. The expression and ratio of SMAD7 and SMAD4 were analyzed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) in tumor and non-tumor primary and metastatic CRC tissues, seven human cell lines, and SW620 cells treated with chemotherapeutics. SMAD7 3′UTR was analyzed by direct sequencing, followed by the relative quantification of differential allelic expression of detected variants by allele-specific qRT-PCR and in silico predictions of their regulatory consequences. The results showed changes in the expression ratio of SMAD7 and SMAD4 in tumors and treatment response, elevated SMAD7 expression in tumors obtained from responders to neoadjuvant chemoradiotherapy (nCRT) compared to non-responders, and four different single nucleotide variants (SNVs) in 3′UTR (among which one novel somatic point variant) that all exhibited variable extents of allelic imbalance in expression and altered miRNA-binding. Changes in the expression ratio of SMAD7 and SMAD4 in CRC cell lines and tissues emphasize the importance of SMAD7/SMAD4 balance disruption for disease progression. Differential expression of SMAD7 in responders versus non-responders to nCRT should be further investigated for its potential predictive value. The expression imbalance observed in the SNV alleles altering miRNA binding suggests that all investigated SNVs are possible contributing factors impacting SMAD7 expression regulation in CRC.