Molekularni mehanizmi protektivnog dejstva grafenskih kvantnih tačaka u in vitro modelu oštećenja neuronskih ćelija oksidativnim stresom

Abstract

U ovoj doktorskoj disertaciji ispitivani su molekularni mehanizmi protektivnog dejstva grafenskih kvantnih tačaka (GKT) u oksidativnom stresu indukovanom natrijum nitroprusidom (engl. sodium nitroprusside, SNP) u ćelijama humanog neuroblastoma. Povećane koncentracije reaktivnih kiseoničnih (RKV) i azotnih vrsta (RAV) unutar ćelija indukuju oksidaciju i nitraciju proteina, peroksidaciju lipida i oštećuju molekul DNK, što dovodi do apoptoze ili nekroze ćelija. Nervne ćelije su posebno osetljive na oštećenja uzrokovana oksidativnim stresom usled značajne potrošnje molekulskog kiseonika, visokih koncentracija višestruko nezasićenih masnih kiselina podložnih procesu lipidne peroksidacije i slabih antioksidativnih mehanizama. Visoki nivoi RKV i RAV dovode do oštećenja i smrti neuronskih i glijalnih ćelija, koja je u osnovi patogeneze Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti, multiple skleroze i ishemijske bolesti mozga. Usled ograničenja postojeće antioksidativne terapije, noviji pristupi bazirani su na antioksidativnim svojstvima sintetičkih materijala, od kojih se ističu GKT. GKT su ovalne ugljenične dvodimenzionalne nanočestice, koje se karakterišu izrazitom biokompatibilnošću, niskom citotoksičnošću i izraženim antioksidativnim karakteristikama. Uz to, GKT indukuju proces autofagije, koji predstavlja mehanizam razgradnje oštećenih ćelijskih organela i proteina u autolizozomima nastalim spajanjem lizozoma i autofagozoma. Neuroni su veoma osetljivi na poremećaje proteolitičke razgradnje ćelijskog materijala u procesu autofagije, a povećano nakupljanje oštećenih proteina predstavlja osnovu patogeneze brojnih neurodegenerativnih oboljenja. U ovoj doktorskoj disertaciji ispitani su molekularni mehanizmi koji se nalaze u osnovi antioksidativnih i proautofagnih karakteristika GKT. Rezultati istraživanja pokazali su da GKT smanjuju citotoksičnost indukovanu SNP, utičući na smanjenje mitohondrijalne depolarizacije, aktivnosti kaspaze-2 i apoptotske smrti SH- SY5Y ćelija humanog neuroblastoma. Iako je tretman GKT smanjivao nivo azot (II) oksida (NO) nakon tretmana SNP, tretman supstancama koje vezuju NO nisu imale značajan uticaj na uočenu protekciju SH-SY5Y ćelija. Pokazano je da neutralizacija NO nije ključan mehanizam u GKT indukovanoj zaštiti ćelija od citotoksičnosti SNP. Tretman GKT smanjivao je nivoe hidroksilnog radikala (OH•), superoksidnog radikala (O2•−) i lipidne peroksidacije indukovane SNP. Tretmani neselektivnim antioksidantima, kao i supstancama sa sposobnošću vezivanja OH• i jona gvožđa (Fe2+), ukazali su da GKT štite ćelije neutrališući OH• nastao u reakciji Fe2+ jona oslobođenih iz SNP i vodonik peroksida (H2O2). Unutarćelijska lokalizacija GKT neophodna je za zaštitu ćelija od oksidativnog stresa indukovanog SNP. Kombinovani tretman GKT i SNP takođe je indukovao autofagiju inhibicijom Akt/PRAS40/mTOR signalnog puta. Indukcija autofagije pokazana je na transkripcionom i post-translacionom nivou. Antioksidativne i proautofagne karakteristike GKT nisu međusobno uslovljene, s obzirom da tretman antioksidansima (N-acetilcistein i DMSO) nije indukovao autofagiju u kombinovanom tretmanu sa SNP. Tretman farmakološkim inhibitorima rane (vortmanin i 3-metiladenin) i kasne faze autofagije (amonijum hlorid) smanjio je protektivno dejstvo GKT, što potvrđuje ulogu autofagije u ovom procesu. Dobijeni rezultati ukazuju da GKT štite SH-SY5Y ćelije od neurotoksičnosti indukovane SNP delujući dvostruko, kao antioksidansi i aktivatori citoprotektivne autofagije. Ispitivanje efekata GKT u ovom modelu citotoksičnosti moglo bi da doprinese razjašnjavanju molekularnih mehanizama koji se nalaze u osnovi njihovog neuroprotektivnog dejstva. Od naročitog značaja u ovom kontekstu je uticaj modulacije oksidativnog stresa i autofagije, kao bitnih regulatora neurotoksičnosti sa potencijalnom ulogom u terapiji neurodegenerativnih i neuroinflamatornih oboljenja.

This dissertation examined the molecular mechanisms of graphene quantum dot (GQD)- mediated protection of the human neuroblastoma cells from oxidative stress induced by sodium nitroprusside (SNP). Increased intracellular levels of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species (RNS) are involved in protein oxidation and nitration, lipid peroxidation and DNA damage, which ultimately lead to apoptotic or necrotic cell death. Neurons are particularly sensitive to the damage caused by oxidative stress due to significant consumption of molecular oxygen, high concentrations of unsaturated fatty acids susceptible to lipid peroxidation, and weak antioxidant mechanisms. High levels of ROS and RNS are involed in the damage and death of neurons and glia in Parkinson's disease, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, and ischemic brain damage. Due to the limitations of existing antioxidant therapy, newer approaches are based on the antioxidant properties of synthetic materials, out of which GQD have shown the most promise. GQD are oval, two-dimensional carbon nanoparticles, characterized by their distinctive biocompatibility, low cytotoxicity and exceptional antioxidant properties. In addition to antioxidant characteristics, GQD can induce autophagy, a cellular mechanism used for degradation of the damaged cell compartments and proteins in autolysosomes, formed by the fusion of lysosomes and autophagosomes. Neurons are particularly sensitive to disturbances in proteolitic cellular material degradation in the autophagy process, and the increased accumulation of damaged proteins is the main cause of numerous neurodegenerative diseases. This research examined the molecular mechanisms of the antioxidative and proautophagic actions of GQD. The results of this study showed that GQD reduce SNP cytotoxicity through the decrease of mitochondrial depolarization, caspase-2 activity, and the apoptotic death of the human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Although GQD reduced the levels of nitric oxide (NO) after SNP treatment, NO scavengers only slightly reduced the cytoprotective effect of GQD in SH-SY5Y cells. The results show that NO quenching is not the main cytiprotective mechanism of GQD. GQD reduced the levels of hydroxyl radical (OH•), superoxide radical (O2-•) and lipid peroxides detected after the SNP treatment. Treatments with nonselective antioxidants and scavengers of OH• and iron ion (Fe2+) indicated that GQD protect cells by neutralizing the high levels of OH• generated in the presence of SNP-released Fe2+ and the intracellular hydrogen peroxide (H2O2). The cytosolic localisation of GQD is necessary for the protection of SH-SY5Y cells from the SNP-induced oxidative stress. Also, the combined treatment with GQD and SNP induced autophagy via Akt/PRAS40/mTOR signalling pathway. The induction of autophagy has been observed at both transcriptional and post-translational levels. The antioxidative effects of GQD were not directly related to their ability to induce autophagy, since the treatment with antioxidants (N-acetylcisteine and DMSO) did not induce autophagy in combination with SNP. In addition, treatments with pharmacological inhibitors of early (wortmannin and 3- methyladenine) and late (ammonium chloride) stages of autophagy effectively reduced the protective effects of GQD. The results of this dissertation suggest that GQD protect SH-SY5Y cells from the SNP- induced neurotoxicity by exerting dual, antioxidant and pro-autophagic action. Examining the effects of GQD on the SNP-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells could contribute in elucidating the molecular mechanisms underlying their neuroprotective action. Of particular importance in this context is to determine the influence of oxidative stress and autophagy modulation, considering their roles as important regulators of neurotoxicity with therapeutic potential in neurodegenerative and neuroinflammatory diseases.