Intrinsically disordered proteins of the European corn borer Ostrinia nubilalis (Hbn, 1796)

Abstract

Intrinsically disordered proteins (IDPs) are a specific and diverse group of proteins that, under physiological environmental conditions, do not possess higher levels of structural organization, but are found in a form resembling denatured proteins. When IDPs are exposed to conditions that are denaturing for ordered proteins, such as high and low temperatures or strongly acidic or basic pH of environment, they acquire transient forms of ordered structure. Also, a large number of typically ordered, globular proteins have intrinsically disordered regions (IDRs) in their structure. Contrary to the established view that the function of proteins depends on their ordered structure, research has shown that IDPs possess various molecular functions regardless of the absence of structure. Due to the lack of higher orders of structure, IDPs have the ability to recognize a large number of different biomolecules and interact with them, and during these interactions they partially fold and acquire a more ordered structure. Due to their flexibility and plasticity in intermolecular interactions, IDPs and proteins with intrinsically disordered regions are often involved in cell signaling processes, regulation of transcription and translation, and also function as molecular chaperones. Based on their diverse roles, as well as resistance to denaturation under unfavorable conditions, IDPs probably have a pronounced biological significance in adaptive processes of organisms to abiotic stress factors. In order to evaluate their potential importance in the process of adaptation to hypometabolic living conditions during phases of arrested development and developing cold resistance, in this dissertation 5th instar larvae of th European corn borer Ostrinia nubilalis were used. In order to survive the cold winter months this species enters a specific resting state called diapause. During diapause, corn borer larvae undergo biochemical and molecular changes that allow them to survive only on stored energy sources and to develop resistance to extremely low winter temperatures. For this reason, the European corn borer is often used as an in vivo model system for studying these processes. In this dissertation, a method was established and optimized for enriching the content of IDPs, validation of the enrichment procedure with specific 2D polyacrylamide gel electrophoresis and isolation of disordered proteins from whole-body homogenates of larvae that were subjected to different temperature treatments to develop low temperature resistance. Isolated proteins were identified using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Also, the degree of intrinsic disorder of the identified proteins was determined by in silico analyses, quantitative and qualitative parameters of their disorder were evaluated, and the functional characterization of the proteins was performed. The relative expression of selected genes for proteins with a significant degree of intrinsic disorder was also examined in 5th instar larvae that were reared under non-diapausing conditions, as well as diapause-inducing conditions that also lead to the development of cold resistance. The results showed that in this species there is a significant content of IDPs and proteins with disordered regions, and that the proportion of proteins with IDRs is correlated with the acquisition of cold resistance. The expression of most of the analyzed genes is also correlated with this adaptation. The results of this dissertation provide new insights into the molecular basis of processes that enable the European corn borer to adapt to unfavorable living conditions characterized by a reduced metabolic rate, limited energy sources for basal metabolism, as well as the negative effects of exposure to low temperatures on the functional and structural homeostasis of proteins and processes they are involved in.

Структурно-неуређени протеини (енгл. intrinsically disordered proteins, IDP-ови) су специфична и разноврсна група протеина који при физиолошким условима средине не поседују више нивое структурне организације, већ се налазе у облику који наликује денатурисаним протеинима. Када су IDP-ови изложени условима који су денатуришући за уређене протеине, као што су високе и ниске температуре или изразито кисела или базна pH средине, они задобијају пролазне облике уређене структуре. Такође, велик број типично уређених, глобуларних протеина у својој структури поседују регионе који могу бити структурно-неуређени (енгл. Intrinsically disordered regions, IDR-ови). У супротности са устаљеним виђењем да функција протеина зависи од њихове уређене структуре, истраживањима је показано да IDP ови поседују разноразне молекуларне функције без обзира на одсуство структуре. Услед одсуства виших нивоа структуре, IDP-ови имају способност препознавања великог броја других биомолекула и интераговања са њима, а приликом тих интеракција се делимично савијају и задобијају пролазу уређену структуру. Због своје флексибилности и пластичности у међумолекулским интеракцијама, IDP-ови и протеини са структурно-неуређеним регионима често су укључени у процесе ћелијског сигналинга, регулацију транскрипције и транслације, а поседују и функције молекуларних шаперона. На основу њихових разноликих улога, као и отпорности на денатурацију у неповољним условима, IDP-ови вероватно имају изражен биолошки значај у процесима адаптација организама на абиотске факторе стреса животне средине. Како би се проценио њихов претпостављени значај у процесу адаптације организма на хипометаболичке услове живота током фазе мировања и развијања отпорности на хладноћу, у овој дисертацији коришћене су гусенице 5. инстара врсте кукурузног пламенца Ostrinia nubilalis. За ову врсту је карактеристично да у зимском периоду улази у фазу мировања звану дијапауза, како би преживела хладне зимске месеце. Током дијапаузе, у гусеницама кукурузног пламенца долази до промена на биохемијском и молекуларном нивоу које им омогућавају да преживе само на ускладиштеним изворима енергије као и да развију отпорност на изузетно ниске зимске температуре. Због тога се кукурузни пламенац често користи као in vivo модел-систем у истраживањима ових процеса. У овој дисертацији успостављена је и оптимизована метода за обогаћивање садржаја IDP ова, валидацију поступка обогаћивања специфичном 2Д електрофорезом на полиакриламидном гелу и изолацију неуређених протеина из хомогената целих гусеница које су подвргаване различитим температурним третманима за развој отпорности на ниске температуре. Изоловани протеини су идентификовани помоћу течне хроматографије купловане са тандемском масеном спектрометријом. Такође, in silico анализама су утврђени степен структурне неуређености идентификованих протеина, процењени квантитативни и квалитативни параметри њихове неуређености и урађена је функционална карактеризација протеина. Испитана је и релативна експресија одабраних гена за протеине са утврђеним значајним степеном структурне неуређености у гусеницама 5. инстара држаним у условима недијапаузе, као и дијапаузе уз развијање отпорности на хладноћу. Резултати су показали да у овој врсти постоји значајан удео IDP-ова и протеина са неуређеним регионима, као и да је удео протеина са IDR-овима корелисан са стицањем отпорности на хладноћу. Експресија већине анализираних гена је такође корелирана са том адаптацијом. Резултати ове дисертације дају нове увиде у молекуларне основе процеса који омогућавају врсти кукурузног пламенца да се прилагоди неповољним условима живота које карактеришу смањена стопа метаболизма, ограничени извори енергије за потребе базалног метаболизма, као негативне ефекте излагања ниским температурама на структурну и функционалну хомеостазу протеина и процеса у којима су они укључени.

Strukturno-neuređeni proteini (engl. intrinsically disordered proteins, IDP-ovi) su specifična i raznovrsna grupa proteina koji pri fiziološkim uslovima sredine ne poseduju više nivoe strukturne organizacije, već se nalaze u obliku koji nalikuje denaturisanim proteinima. Kada su IDP-ovi izloženi uslovima koji su denaturišući za uređene proteine, kao što su visoke i niske temperature ili izrazito kisela ili bazna pH sredine, oni zadobijaju prolazne oblike uređene strukture. Takođe, velik broj tipično uređenih, globularnih proteina u svojoj strukturi poseduju regione koji mogu biti strukturno-neuređeni (engl. Intrinsically disordered regions, IDR-ovi). U suprotnosti sa ustaljenim viđenjem da funkcija proteina zavisi od njihove uređene strukture, istraživanjima je pokazano da IDP ovi poseduju raznorazne molekularne funkcije bez obzira na odsustvo strukture. Usled odsustva viših nivoa strukture, IDP-ovi imaju sposobnost prepoznavanja velikog broja drugih biomolekula i interagovanja sa njima, a prilikom tih interakcija se delimično savijaju i zadobijaju prolazu uređenu strukturu. Zbog svoje fleksibilnosti i plastičnosti u međumolekulskim interakcijama, IDP-ovi i proteini sa strukturno-neuređenim regionima često su uključeni u procese ćelijskog signalinga, regulaciju transkripcije i translacije, a poseduju i funkcije molekularnih šaperona. Na osnovu njihovih raznolikih uloga, kao i otpornosti na denaturaciju u nepovoljnim uslovima, IDP-ovi verovatno imaju izražen biološki značaj u procesima adaptacija organizama na abiotske faktore stresa životne sredine. Kako bi se procenio njihov pretpostavljeni značaj u procesu adaptacije organizma na hipometaboličke uslove života tokom faze mirovanja i razvijanja otpornosti na hladnoću, u ovoj disertaciji korišćene su gusenice 5. instara vrste kukuruznog plamenca Ostrinia nubilalis. Za ovu vrstu je karakteristično da u zimskom periodu ulazi u fazu mirovanja zvanu dijapauza, kako bi preživela hladne zimske mesece. Tokom dijapauze, u gusenicama kukuruznog plamenca dolazi do promena na biohemijskom i molekularnom nivou koje im omogućavaju da prežive samo na uskladištenim izvorima energije kao i da razviju otpornost na izuzetno niske zimske temperature. Zbog toga se kukuruzni plamenac često koristi kao in vivo model-sistem u istraživanjima ovih procesa. U ovoj disertaciji uspostavljena je i optimizovana metoda za obogaćivanje sadržaja IDP ova, validaciju postupka obogaćivanja specifičnom 2D elektroforezom na poliakrilamidnom gelu i izolaciju neuređenih proteina iz homogenata celih gusenica koje su podvrgavane različitim temperaturnim tretmanima za razvoj otpornosti na niske temperature. Izolovani proteini su identifikovani pomoću tečne hromatografije kuplovane sa tandemskom masenom spektrometrijom. Takođe, in silico analizama su utvrđeni stepen strukturne neuređenosti identifikovanih proteina, procenjeni kvantitativni i kvalitativni parametri njihove neuređenosti i urađena je funkcionalna karakterizacija proteina. Ispitana je i relativna ekspresija odabranih gena za proteine sa utvrđenim značajnim stepenom strukturne neuređenosti u gusenicama 5. instara držanim u uslovima nedijapauze, kao i dijapauze uz razvijanje otpornosti na hladnoću. Rezultati su pokazali da u ovoj vrsti postoji značajan udeo IDP-ova i proteina sa neuređenim regionima, kao i da je udeo proteina sa IDR-ovima korelisan sa sticanjem otpornosti na hladnoću. Ekspresija većine analiziranih gena je takođe korelirana sa tom adaptacijom. Rezultati ove disertacije daju nove uvide u molekularne osnove procesa koji omogućavaju vrsti kukuruznog plamenca da se prilagodi nepovoljnim uslovima života koje karakterišu smanjena stopa metabolizma, ograničeni izvori energije za potrebe bazalnog metabolizma, kao negativne efekte izlaganja niskim temperaturama na strukturnu i funkcionalnu homeostazu proteina i procesa u kojima su oni uključeni.