In silico selekcija i in vitro ispitivanja prirodnih i sintetičkih inhibitora rasta parazita Leishmania spp.

Abstract

Predmet naučnog istraživanja ove doktorske disertacije ,,In silico selekcija i in vitro ispitivanje prirodnih i sintetskih jedinjenja sa potencijalnom inhibitornom aktivnošću na rast Leishmania spp." su prirodna i sintetska jedinjenja sa potencijalnim inhibitornim dejstvom na protozoe iz roda lajšmanija. Osnovni zadatak studije je bio da se in silico metodologijom pronađu odgovarajući kandidati koji pripadaju takvoj grupi jedinjenja i da se njihova aktivnost potvrdi in vitro eksperimentima. Dodatni zadatak je bilo postavljanje hipoteze o mehanizmu dejstva inhibitora na ciljna mesta u telu parazita na osnovu razumevanja interakcija hemijskih jedinjenja kandidata i odabranih metaboličkih enzima. Stečena saznanja imaju za cilj da doprinesu razvoj i dizajn novih aktivnih jedinjenja koja imaju potencijalnu hemoterapijsku primenu u lečenju lajšmanioze sa minimalnim toksičnim dejstvom na ćelije domaćina. Prva faza istraživanja obuhvata: (1) Definisanje kriterijuma za virtuelni skrining baza hemijskih jedinjenja upotrebom molekulskih deskriptora: elektron-jon interakcionog potencijala – EIIP i prosečnog kvazivalentnog broja – AQVN, 3D modela odnosa strukture i aktivnosti – 3D-QSAR i farmakofornog 3D modela zasnovanog na strukturi liganda; (2) Primena homolognog modelovanja enzima čija struktura nije kristalografski utvrđena; (3) razvoj kombinovanog protokola za virtuelni skrining zasnovanog na strukturi liganda i enzma u cilju dobijanja novih inhibitora rasta lajšmanije; (4) In silico skrining anti-targeta, tj. ispitivanje interakcija potencijalnih inhibitora sa enzimima koji učestvuju u njihovom metabolizmu i koji su prisutni u ćelijama domaćina; (5) Predviđanje apsorpcije, distribucije, metabolizma, ekskrecije i toksičnosti – ADMET i fizičkohemijskih osobina kandidata. Druga faza istraživanja obuhvata: (1) Odabir kandidata sa potencijalnom aktivnošću na lajšmanije na osnovu in silico skrininga, a koji se mogu pronaći u katalogu dobavljača ili koji se pronalaze u dostupnoj bazi prirodnih proizvoda; (2) Dobijanje odabranih kandidata automatizovanom sintezom; (3) In vitro ispitivanje aktivnosti inhibitora porekla na Leishmania spp. Definisan je protokol virtuelnog skrininga, a potom primenjen za pretragu baze MetIDB od 5.667 jedinjenja, upotrebom EIIP/AQVN filtera i 3D-QSAR. Jedinjenja sa najboljim rezultatima pretrage su potom dokovana u model humane i arginaze lajšmanije kao i anti-target modele koje čine citohromi P450 familije enzima 2a6, 2c9, 3a4, sulfotransferaza i pregnan-X-receptor sa ciljem označavanja neželjenih receptor-ligand interakcija u toku metabolizma. Upotreba ove metode utiče na donošenje odluke o odabiru kandidata koji potencijalno imaju umanjena toksična i neželjena dejstva u toku lečenja lajšmanioze. Pripremljena je serija novih sintetskih jedinjenja, derivata oksadiazola i indolizina. Za ova jedinjenja su izračunati EIIP i AQVN deskriptori na osnovu kojih je formiran domen za upotrebu u narednom koraku, tj. skriningu zasnovanom na strukturi liganda. Najbolji kandidati su dokovani u model humane arginaze i finalno okarakterisani na osnovu dokinga u grupe anti-target enzima, kako bi se ispitala mogućnost interakcije sa proteinima esencijalnim za njihov metabolizam. Osam kandidata je testirano in vitro. Rezultati pokazuju da antilajšmanijalna aktivnost postoji za tri od osam kandidata. Najbolji kandidat sa 2,18 μM IC50 na amastigote Leishmania donovani u makrofagama, predstavlja interesantnu strukturu za razvoj novih agensa sa dejstvom na lajšmanije. Primenom strukturnih podataka izozima, modelovana je 3D struktura Leishmania infantum alternativne NADH dehidrogenaze (tip 2) upotrebom metoda prepoznavanja homologa. Virtuelnim skriningom je izvršena pretraga potencijalnih inhibitora koji kao ciljno mesto dejstva imaju LiNDH-2 ubikvinon-vezivno mesto...

he subject of this dissertation titled: "In silico selection and in vitro testing of natural and synthetic compounds inhibitors of Leishmania spp growth" is the natural and synthetic compounds that act as growth inhibitors of the protozoa of the genus Leishmania. The main objective of this study is to identify such compounds using in silico methodology and evaluate the activity by in vitro experiments. A further aim is to hypothesize the mechanism of action against specific targets within the parasite body, based on an understanding of molecular interactions with specific metabolic enzymes. These research findings should be used to develop targeted drugs against leishmaniasis that reduce the risk of toxic effects on host cells. The first phase consists of (1) defining the criteria for virtual screening of compound databases using the descriptors: electron-ion interaction potential – EIIP and average quasivalence number - AQVN, quantitative structure-activity relationship - 3D-QSAR and ligand-based pharmacophore model. (2) The application of homology modeling to elucidate target structure necessary for receptor-ligand interactions with parasite and the host, for those enzymes for which crystallographic structure is not available; (3) The development of VS protocol comprising ligand-based and structure-based methods to obtain inhibitors of Leishmania growth; (4) In silico anti-target screening, viz.i.e. qualification of receptor-ligand interactions of the potential inhibitors against host metabolic enzymes; (5) The prediction of absorption, distribution, metabolism, excretion and toxicity - ADMET and physicochemical properties of the selected candidates. The second phase of research involves: (1) the selection of candidates with potential activity against leishmaniasis based on in silico screening, found in the supplier's catalog or in the available database of natural products; (2) the extraction of selected candidates by automated synthesis; (3) the in vitro study of the inhibitory activity of Leishmania spp. After defining VS protocol, an initial screening was performed using an EIIP/AQVN filter and 3D-QSAR against the MetIDB database of 5,667 compounds. Top hits were screened in silico against human and Leishmania arginase and an anti-target model consisting of cytochromes P450 2a6, 2c9, 3a4, sulfotransferase, and the pregnane X receptor to flag unfavorable ligand-protein interactions during compound metabolism. Using this method as a filter affects the decision of choosing compounds which may produce fewer toxic and adverse effects in the treatment of leishmaniasis. A series of novel oxadiazoles and indolizine-containing compounds were synthesized. Then, EIIP and AQVN values were calculated for each compound and only those that belonged to a predefined domain during ligand-based virtual screening were selected. Molecular docking of the selected candidates using a parasite arginase model was performed. The top hits were further docked to human arginase and characterized by docking to anti-target enzymes to mark their possible interactions with enzymes essential for their metabolism. Eight candidate compounds were selected for further experimental testing. The results show measurable in vitro anti-leishmanial activity for three out of eight compounds...