Испитивање модулације сенесценције индуковане хидроксиуреом на модел систему хуманих мезенхималних стромалних ћелија

Abstract

Мезенхималне стромалне ћелије (МСЋ) су популација матичних ћелија које се одликују имунорегулаторним карактеристикама и диференцијационим потенцијалом ка остеобластима, хондроцитима и адипоцитима. МСЋ се могу изоловати из скоро свих адултних ткива а најчешће се добијају из костне сржи. Познато је да ови прогенитори који се налазе у циркулацији и костној сржи могу имати улогу како у стимулацији тако и у инхибицији пролиферације малигних ћелија и индукције профибротичног фенотипа. На карактеристике МСЋ могу утицати бројни фактори попут инфламаторних цитокина, реактвних кисеоничних врста (енг. reactive oxygen species, ROS), азот моноксида (енг. nitric oxide, NO) и индуктора стреса који се повезују и са настанком ћелијског старења, сенесценције. Хидроксиуреа (ХУ) је антинеопластични агенс који инхибира рибонуклеотид-редуктазу и користи се у терапији хематолошких малигнитета. Познато је да ХУ има цитостатски ефекат и проузрокује ДНК оштећење које може водити у превремену сенесценцију, али утицај ХУ на карактеристике МСЋ и интеракцију са ћелијама у околини посредством узгредног, bystander ефекта није до сада проучаван. Циљ ове студије био је да се анализира ефекат ХУ на карактеристике МСЋ, као што су морфологија, имунофенотип, диферецијациони капацитет, испољеност сенесцентног фенотипа, имуномодулаторне, профибротичне способности ових ћелија као и њихову улогу у туморогенези. Методе: МСЋ су успешно изоловане из периферне крви и костне сржи здравих донора а потом су окарактерисане према критеријумима Комитета за МСЋ Међународног друштва за ћелијску терапију. Генотоксични ефекат, индукција сенесцентних и профибротичних маркера под утицајем ХУ су анализирани имунохистохемијском и имунофлуоресцентном методом. Продукција унутарћелијског ROS (енг. reactive oxygen species) и NO (енг. nitric oxide) је анализирана употребом флуоресцентних реагенаса DCF и DAF. Анализа ћелијског циклуса и пролиферације, као и детекција површинских антигена је извршена методом проточне цитометрије. Утицај ХУ на активацију mTOR, MAPK, JAK/STAT и TGFbeta/SMAD сигналних путева процењен је методом имуноблота. Резултати: МСЋ су окарактерисане према способности адхерирања за пластику, експресији мезенхималних уз одсуство хематопоетских површинских антигена и диференцијационом потенцијалу ка остеобластима и адипоцитима...

Mesenchymal stromal cells (MSC) are the population of stem cells with immunoregulatory features and significant differentiation potential towards osteoblast, chondrocytes and adipocytes. MSC have been isolated from abundant adult tissues, most frequently from bone marrow. As a circulating and the bone marrow microenvironment progenitors, those cells have a dual role as a promoters or inhibitors of both, malignant cell proliferation and profibrotic phenotype induction. Variation of MSC characteristics are associated with numerous factors such as inflammatory cytokines, reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO) and stress inducers that could also induce senescence. Hydroxyurea (HU) is an antineoplastic agent that functions as the ribonucleotide reductase inhibitor and is mainly used in the treatment of hematological malignancies. As a DNA replication stress inducer HU may trigger a premature senescence-like cell phenotype, though its influence on MSC characteristics and repercussion on bystander cell proliferation has not elucidated yet. The aim of this study was to estimate the effect of HU on MSC morphology, immunophenotype, multilineage differentiation, senescencent phenotype, immunomodulatory and profibrotic activity as well as the roll of the HU treated MSC in tumorogenesis. Methods: MSC were successfully isolated from bone marrow and peripheral blood healthy donors. They were characterised in the presence and absence of HU, by criteria from MSC Committee of the International Society for Cellular Therapy. Genotoxic effect of HU, as well as the expression of senescence and profibrotic markers, were estimated by immunohistochemistry and immunofluorescence. Intracellular ROS and NO production was determined by fluorogenic molecules DCF and DAF. Cell cycle analysis, cell proliferation and surface markers detection was performed by flow cytometry. Influence of HU on activation of mTOR, MAPK, JAK/STAT and TGF/SMAD were determined by immunoblothing methods. Results: MSC were characterised by their plastic surface adhesion, expression of mesenchymal cell surface markers, lack of the expression of hematopoietic markers and the capacity to differentiate towards osteoblast and adipocytes. Examining the HU effect on MSC, we found that HU has the mild cytostatic effect and provokes cell cycle arrest in the S phase as the consequence of the DNA damage response evidenced by expression of gamaH2A.X and micronuclei...