Analiza prirode rezistencije na hinolone i molekularna tipizacija odabranih serotipova Salmonella enterica subspecies enterica

Abstract

Salmoneloze spadaju među najznačajnije zoonoze u svetu. S obzirom da se ljudi zaražavaju najčešće putem konzumacije hrane životinjskog porekla, nadzor nad salmonelama neophodan je u svakom stadijumu proizvodnje hrane od farme do viljuške. Širenje rezistencije na hinolone među salmonelama predstavlja veliki javno zdravstveni problem zbog uticaja na lečenje ljudi i životinja. Cilj istraživanja je bio da se ispita mogućnost brze i efikasne tipizacije Salmonella enterica subspecies enterica serotip Enteritidis (S. Enteritidis) kao najčešćeg serotipa kod ljudi i učestalost i molekularni mehanizmi rezistencije na hinolone kod salmonela. U kolekciji izolata S. Enteritidis poreklom od ljudi, pilića i iz namirnica živinskog porekla, kombinacijom RAPD-PCR tipizacije sa četiri prajmera, rezistotipizacije i polimorfizma mutacija u regionu gyrA gena koji kodira rezistenciju na hinolone (QRDR), diskriminisano je 22 genetičke grupe sa indeksom diskriminacije 0.828. Svi izolati bili su visoko srodni, a tipizacija je dokazala nasumičnu raspoređenost tipova u sve tri kategorije izolata, odnosno cirkulaciju sojeva kroz razne stadijume lanca ishrane. RAPD-PCR tipizacija uspešno je izdvojila epidemijski soj među tri izolata S. Enteritidis iz jednog restorana brze hrane. Analizom uzoraka iz fabrike biskvita ustanovljena je kontaminacija sa najmanje četiri soja S. Enteritidis i povezanost serotipa Enteritidis sa jajima kao izvorom kontaminacije. Analizom većeg uzorka izolata poreklom od namirnica i ljudi sa teritorije Južnobačkog okruga u šestogodišnjem periodu ustanovljena je mala učestalost rezistencije S. Enteritidis na antibiotike, retka pojava višestruke rezistencije na antibiotike i mala učestalost rezistencije na hinolone (2.9%). Nađena su tri tipa mutacija odgovornih za rezistenciju na hinolone u QRDR regionu: Asp87Asn, Asp87Gly i Ser83Phe. Dominirale su mutacije na 87. poziciji i to Asp87Asn supstitucija. Nisu nađeni dokazi o klonalnom širenju sojeva rezistentnih na nalidiksičnu kiselinu. Rezistencija na fluorohinolone nije otkrivena. Dokazana je smanjena osetljivost na fluorohinolone kod S. Enteritidis rezistentnih na nalidiksičnu kiselinu. Kod drugih serotipova salmonela rezistencija na nalidiksičnu kiselinu i udruženost sa više markera rezistencije bila je učestalija nego kod S. Enteritidis, naročito kod S. Hadar. Rezistencija na ampicilin i nalidiksičnu kiselinu bile su najčešće kod salmonela bez obzira na serotip. Diskriminativna moć i jednostavnost RAPD-PCR metode sa četiri prajmera udružene sa rezistotipizacijom preporučuju ih kao efikasan sistem tipizacije prilikom nadzora nad kretanjem salmonela u humanoj i životinjskoj populaciji. Ispitivanje rezistencije na antibiotike, a naročito na hinolone kod salmonela neophodno je u cilju upozoravanja kliničara na terapijske rizike, a sa epidemiološkog aspekta, radi detekcije pojave i širenja opasnih sojeva.

Salmonelloses are among most significant zoonoses in the world. Since people are most often infected by consumption of food of animal origin, surveillance of salmonella is necessary in every stage of food production from farm to fork. Emergence of resistance to quinolones among salmonella is a significant public health problem, considering implications on the treatment of humans and animals. The aims of the investigation were to analyze the possibility of fast and efficient typing of Salmonella enterica subspecies enterica serotype Enteritidis (S. Enteritidis) as the most frequent serotype in humans and to investigate frequency and molecular mechanisms determining resistance to quinolones in salmonella. In a collection of S. Enteritidis isolates originating from humans, poultry and marketed poultry products and eggs, a combination of RAPD-PCR typing with four primers, resistotyping and polymorphism of mutations in quinolone resistance determining region (QRDR) of gyrA gene revealed 22 genetic groups with discrimination index of 0.828. All isolates were closely related and typing has proved random distribution of types in all three categories of isolates, ie. circulation of strains through subsequent stages of food chain. RAPD-PCR typing succesfully discriminated epidemic strain among 3 S. Enteritidis isolates from one fast food restaurant. Analysis of samples from one biscuit factory showed contamination with at least four strains of S. Enteritidis and strong connection of serotype Enteritidis with eggs as a source of contamination. Analysis of larger collection of isolates from food and humans in Southern Bačka county in a six-year period revealed low frequency of resistance of S. Enteritidis to antibiotics, rare occurence of multiple resistance to antibiotics and low frequency of resistance to quinolones (2.9%). Three types of mutations determining resistance to quinolones in QRDR were discovered: Asp87Asn, Asp87Gly and Ser83Phe. Mutations at position 87 are dominant, with Asp87Asn as the most frequent. There was no evidence of clonal spread of strains resistant to quinolones. Resistance to fluoroquinolones was not detected. Reduced susceptibility to fluoroquinolones among S. Enteritidis resistant to nalidixic acid was proved. Resistance to nalidixic acid and association with multiple antibiotic resistance were more common among other serotypes of salmonella, especially in S. Hadar, than among S. Enteritidis. Resistance to ampicillin and nalidixic acid were the most common in all investigated salmonella serotypes. Discriminative power and simplicity of RAPD-PCR method with four primers together with resistotyping recommend them as the efficient typing system for monitoring of salmonella in human and animal population. Investigation of resistance to antibiotics, especially to quinolones among salmonella is essential for alerting clinicians for therapy risks, and from epidemiological aspect, for detection of emergence and spread of dangerous strains.