Mikrobiološka precipitacija karbonata – od odabira induktora do ispitivanja bioprocesnih parametara

Abstract

U okviru ove doktorske disertacije prikazan je postupak izolovanja i selekcije bakterija sa biokalcifikujućim potencijalom, definisanih kao sporogeni i alkalorezistentni/alkalofilni predstavnici mikrobne populacije kalcitnih zemljišta iz okoline grada Novog Sada. U okviru istraživanja koja su obuhvaćena ovom disertacijom, izolovano je pet ureolitičkih bakterija koji su pomoću metode MALDI-TOF masene spektroskopije identifikovani kao Bacillus muralis, B. lentus, B. simplex, B. firmus i B. licheniformis (prethodno označenih po mestu uzorkovanja kao II8, II10, III11, III15, IV5, redom). U svim eksperimentima, karakteristike i performanse novoizolovanih sojeva su poređene sa referentnom kulturom Sporosarina pasteurii DSM 33. Primenom PCR metode amplifikovan je glavni strukturni ureolitički gen (ureC) u genomu svih Bacillus izolata i referentnog soja, čime je dokazano da ispitivani sojevi imaju genetsku predispoziciju za efikasnu hidrolizu uree kao supstrata u hranljivom medijumu. Za opisane izolate dokazano je da su efikasni induktori precipitacije kalcijum karbonata (CaCO3), te da poseduju fiziološke i morfološke predispozicije za proces bakterijski indukovane precipitacije CaCO3 (BIPK). Ispitivanjem fizičkih karakteristika ćelije i njenih površinskih struktura (zida i membrane), uticaja ćelijske aktivnosti na pH promene tokom BIPK, kao i praćenje uloge kalcijuma u toku ciljanog procesa, konstantovano je da je uloga štapićastih bakterija višestruka, te da su, pored metaboličke aktivnosti, značajne i testirane karakteristike pojedinačnih vijabilnih ćelija. Takođe, uz praćenje kinetike ureolitičke aktivnosti i nusprocesa (pH promene i koncentracija bakterija), kao i kinetike BIPK i nusprocesa (pH promene i koncentracija kalcijumovih jona), urađeno je kinetičko modelovanje sistema sa dobrim prediktivnim kapacitetom. Strukturna karakterizacija precipitata dobijenih tokom kinetičkih studija ukazala je na visoku kristaličnost CaCO3, sa različitom raspodelom kalcitne i vateritne faze, zavisno od vremena inkubacije i bakterijskog soja. Dodatno, izvršena je analiza 11 parametara sredine i sastava hranljive podloge u toku procesa BIPK u cilju procene robusnosti sistema, efikasnosti ciljanog procesa i odabira bakterijskog izolata sa najvećim potencijalom sa efikasan proces precipitacije. Sumarno, u okviru doktorske disertacije izolovanjem i karakterizacijom visokoefikasnih ureolitičkih bakterija sa biokalcifikujućim potencijalom i detaljnim prikazom eksprimentalnih koraka od izolovanja i selekcije do izbora najpogodnije bakterije za BIPK proces, načinjeni su dobri temelji i prvi koraci ka definisanju idejnog rešenja upotrebe BIPK procesa u inženjerske svrhe.

Within the research involved in this PhD thesis, the procedure of isolation and selection of bacteria with biocalcifying potential, defined as sporogenic and alkaloresistant/alkalophilic representatives of the microbial population of calcite soils near Novi Sad, Serbia is presented. Five ureolytic bacteria were isolated as a potential good choice for bacterially induced precipitation of CaCO3 (BIPK) and identified by the MALDI-TOF mass spectroscopy method as Bacillus muralis, B. lentus, B. simplex, B. firmus, and B. licheniformis (previously marked by the sampling site as II8, II10, III11, III15, IV5, respectively). In all experiments, the characteristics and performance of newly isolated strains were compared with the reference culture Sporosarina pasteurii DSM 33. The main structural ureolytic gene (ureC) in the genome of all Bacillus isolates and the reference strain was amplified using the PCR method, which suggest that the tested strains have a genetic predisposition for hydrolysis of urea as a substrate in a nutrient media. The selected isolates have been proven to be effective inducers of calcium carbonate (CaCO3) precipitation and to have physiological and morphological predispositions for the BIPK process. The results of validation of the physical characteristics of the cell and its surface structures (wall and membrane), the influence of cellular activity on pH changes during BIPK, as well as monitoring the role of calcium during the target process, showed that the role of rod bacteria is not only in terms of metabolic activity but also in terms of the contribution of individual, viable cells. Furthermore, by monitoring the kinetics of ureolytic activity and by-processes (pH change and bacterial concentration), as well as the kinetics of BIPK and by-processes (pH change and calcium ion concentration), kinetic modeling of systems with good predictive capacity was performed. Structural characterization of the precipitates obtained during the kinetic studies indicated high crystallinity of CaCO3, with different distribution of calcite and vaterite phases, depending on the incubation time and the bacterial strain. Additionally, an analysis of 11 environmental parameters and nutrient medium composition for BIPK effectivity was performed to assess the robustness of the system, the efficiency of the target process, and the selection of the bacterial isolate with the greatest potential with an efficient BIPK process. In summary, the results obtained in this PhD thesis, by isolating and characterizing highly efficient ureolytic bacteria with biocalcifying potential and detailed presentation of experimental steps from isolation to the selection of the most suitable bacteria with BIPK process, good foundations and first steps towards defining the conceptual solution of using BIPK process in engineering fields were made.