Primena agro-industrijskog otpada za dobijanje enzima destransaharaze i proizvodnja dekstrana i ologosaharida pomoću imobilisanih sistema

Abstract

Predmet istraživanja u okviru ove doktorske disertacije je optimizacija proizvodnje enzima dekstransaharaze, dobijene iz novog soja Leuconostoc mesenteroides T3, na komercijalnoj podlozi i na otpadnom supstratu, kao i imobilizacija ovog enzima na nanočestice TiO2 i unutar agar-agar filmova u cilju proizvodnje dekstrana i glukooligosaharida (GLOS). Novi soj Lc. mesenteroides T3, izolovan iz zrna vodenog kefira korišćen je kao mikroorganizam za proizvodnju i izolaciju dekstransaharaze. Optimalna podloga za maksimalnu proizvodnju enzima dobijena je variranjem uslova gajenja (kao što su temperatura i aeracija) i komponenata podloge (koncentracija saharoze i izvora azota). Dekstransaharaza dobijena u optimalnoj podlozi je zatim izolovana i prečišćena taloženjem uz pomoć polietilen glikola 400 (PEG). Karakterizacijom delimično prečišćene dekstransaharaze utvrđeno je da pokazuje najveću aktivnost na 30 0C pri pH vrednosti 5,4 i da dodatak jona Mn2+ ima najveći pozitivan uticaj na povećanje aktivnosti od čak 73 %. Zimogramom je pokazano da dekstransahraza ima molekulsku masu od oko 180 kDa. Karakterizacija proizvoda reakcije katalizovane dekstransaharazom iz radnog mikroorganizma, kada u reakcionoj smeši nisu bili prisutni akceptorski molekuli, izvršena je FTIR spektroskopijom. Potvrđeno je da je molekul glukana koji je sintetisan dekstransaharazom iz Lc. mesenteroides T3 dekstran u kome su molekuli glukoze dominantno povezani α-(1→6) glikozidnim vezama. Za proizvodnju dekstransaharaze na otpadnom supstratu, izluženi repin rezanac (SBP, od engl. sugar beet pulp), veličina zrna 500 μm‒800 μm, korišćen je kao nosač za imobilizaciju ćelija Lc. mesenteroides T3 dok je melasa bila izvor ugljenika, vitamina i mineralnih materija. Ispitivanjem uticaja ne-tretiranog (SBP-N) i izluženog repinog rezanca nakon tretmana sa NaOH (SBP-NaOH) na proizvodnju dekstransaharaze, bolji se pokazao repin rezanac nakon alkalnog pretretmana. Optimalan sastav podloge za maksimalnu proizvodnju dekstransaharaze dobijen je nakon variranja koncentracije melase, SBP-NaOH i saharoze. Najveća vrednost koncentracije enzimske aktivnosti od 2,02 IU/ml dobijena je u podlozi koja je bila sledećeg sastava: 2,5 % melasa, 2,5 % SBPNaOH i 4 % saharoze. Analizom mikrografija skenirajućeg elektronskog mikroskopa utvrđeno je da je došlo do imobilizacije ćelija soja Lc. mesenteroides T3 na i unutar SBPNaOH. Dobijeni rezultati pokazali su da se proizvodnja dekstransaharaze, na supstratu kao što je melasa, može poboljšati korišćenjem alkalno tretiranog izluženog repinog rezanca kao nosača za imobilizaciju bakterijskih ćelija. Jedan od glavnih fokusa ove studije bio je funkcionalizacija komercijalnih nanočestica TiO2 (Degussa P25) u cilju dobijanja nosača sa velikim kapacitetima za imobilizaciju dekstransaharaze. Za uvođenje različitih funkcionalnih grupa na nanočestice TiO2 korišćena su dva sintetska puta. Prvi, koji se zasniva na već poznatoj reakciji silanizacije primenom (3-glicidiloksipropil)trimetoksisilana (GOPTMS-a), doveo je do sinteze nosača sa uvedenim epoksi grupama na nanočestice TiO2 (TiO2/GOPTMS). Drugi, novi sintetski put za modifikaciju površine TiO2 sa amino i aldehidnim grupama, razvijen je korišćenjem prednosti stvaranja kompleksa sa prenosom naelektrisanja (CTC) između površine atoma Ti i liganda tipa slicilata (5-aminosalicilna kiselina (5-ASA)), čime su prvo dobijene amino-modifikovane čestice TiO2 (TiO2/5-ASA). Ove čestice (TiO2/5- ASA) su zatim tretirane glutaraldehidom (GA), što je za rezultat dalo nosač (TiO2/5-ASA/GA) koji na površini poseduje aldehidne grupe koje mogu da formiraju kovalentnu vezu sa molekulom enzima. Delimično prečišćena dekstransaharaza imobilisana je na nemodifikovane i modifikovane nanočestice TiO2 sa amino (TiO2/5-ASA), aldehidnom (TiO2/5-ASA/GA) i epoksi (TiO2/GOPTMS) funkcionalnom grupom. Koncentracija imobilisane aktivnosti za nosač TiO2/5-ASA iznosila je 230 IU/g, za TiO2 funkcionalizovan glutaraldehidom iznosila je 235 IU/g a za nosač funkcionalizovan epoksi grupom 258 IU/g, dok je za nemodifikovane čestice TiO2 iznosila samo 142 IU/g. Ispitana je temperaturna stabilnost dekstransaharaze imobilisane na TiO2 nosače funkcionalizovane glutaraldehidom i epoksi grupom, na 40°C, kao i mogućnost vraćanja u više uzastopnih ciklusa. Nakon pet uzastopnih ciklusa, dekstransaharaza imobilisana na nosač aktiviran glutaraldehidom (TiO2/5-ASA/GA) zadržala je gotovo 70 % od početne koncentracije imobilisane aktivnosti, dok je dekstransaharaza imobilisana na TiO2/GOPTMS nosač zadržala svega 15 % od početne koncentracije imobilisane aktivnosti. Za sintezu GLOS, dekstransaharaza je imobilisana u agar-agar matriks, a kao akceptorski molekul korišćena je maltoza. Na osnovu rezultata prinosa imobilizacije aktivnosti, finalna koncentracija agar-agar matriksa od 2 % se pokazala kao najbolja za dalji rad. Ispitivanjem mehaničkih osobina kao što su (zatezna čvrstoća, Jangov modul elastičnosti i izduženje pri kidanju) utvrđeno je da je 9:1 najbolji odnos u kome bi trebalo da se pomešaju matriks (agar) i enzim za imobilizaciju. Kada je odnos koncentracija maltose i saharoze u reakcionoj smeši bio 6:1, nastao je samo jedan proizvod, trisaharid panoza. Imobilisana dekstransaharaza pokazala je dobru operativnu stabilnost zadržavajući oko 50 % od početne koncentracije imobilisane aktivnosti nakon pet uzastopna ciklusa.

The scope of this doctoral dissertation is the optimization of the production of dextransaccharase (DS) enzyme, obtained from a new strain Leuconostoc mesenteroides T3, using a commercial medium and a waste substrate, as well as the immobilization of this enzyme on TiO2 nanoparticles and within agar-agar and application of these imobilised systems for the production of dextran and glucooligosaccharides (GLOS). A new strain Lc. mesenteroides T3, isolated from water kefir grains, was used as a microorganism for production and isolation of enzyme dextransucrase. The optimal medium for maximum enzyme production was defined by varying the growth conditions (such as temperature and aeration) and the broth/medium components (sucrose concentration and nitrogen source). The enzyme, purified by polyethylene glycol 400 (PEG) fractionation, displayed the maximum activity at 30 0C and pH 5.4. The addition of Mn2+ cation caused a signficant change of DS activity, with 73% increase. Zymogram analysis showed the presence of DS of approximately 180 kDa. Characterization of the dextransucrase catalyzed reaction product, when acceptor molecules were absesent from the reaction mixture, was performed by FTIR spectroscopy. The results indicated that a glucan molecule synthesized by dextransucrase from Lc. mesenteroides T3 was dextran in which glucose molecules were dominantly linked by α- (1 → 6) glycosidic bonds. For the dextransaccharase production on waste substrated, sugar beet pulp (SBP) of grain size 500 μm ‒ 800 μm, was used as a carrier in order to immobilize Lc. mesenteroides T3 cells, while molasses was a source of carbon, vitamins, and minerals. The influence of SBP in native form and after treatment with NaOH (SBP-NaOH) on dextransucrase production was investigated. The optimal substrate composition for maximum dextransucrase production was determined by varying the concentration of molasses, SBP-NaOH and sucrose. The maximum enzyme activity of 2,02 IU/ml was obtained on the medium composed of the following components: 2,5 % molasses, 2,5 % SBP-NaOH, and 4 % sucrose. The scanning electron microscope micrographs showed that immobilization of Lc. mesenteroides T3 cells had occurred on and within SBP-NaOH. The results showed that the production of dextransucrase on a substrate such as molasses can be improved by using alkali-treated sugar beet pulp as a carrier for bacterial cell immobilization. One of the main topics of this study is the functionalization of commercial TiO2 nano-powder (Degussa P25) in order to obtain high-capacity support for the immobilization of DS. Two different synthetic routes were used for the activation of TiO2 support with different functional groups. The first, based on well-known silylation reaction with (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GOPTMS), led to the development of epoxy-functionalized TiO2 powders (TiO2/ GOPTMS). The second one, a novel synthetic route for surface modification of TiO2 with amino and aldehyde groups was developed by taking advantage of charge transfer complex formation between surface Ti atoms and salicylate-type of ligands (5‑aminosalicylic acid (5-ASA)), that first led to the production of amino-modified TiO2 particles (TiO2/ 5-ASA). These particles (TiO2/ 5-ASA) were then treated with glutaraldehyde, resulting in the development of a novel carrier (TiO2 / 5- ASA / GA) that has aldehyde groups on the surface which can easily form a covalent bond with the enzyme molecule.The TiO2 based hybrid supports with different functional groups: amino (TiO2/5- ASA), glutaraldehyde (TiO2/5-ASA/GA) and epoxy (TiO2/ GOPTMS) were prepared and immobilization efficacy of partially purified dextransucrase on these supports was studied. The concentration of immobilized activity for the TiO2/5-ASA was 230 IU/g, for glutaraldehyde functionalized TiO2 carrier was 235 IU/g, for the TiO2 carrier with epoxy group it was 258 IU/g, while for the unmodified TiO2 particles it was only 142 IU/g. The temperature stability of dextransucrase immobilized on TiO2 carriers functionalized with glutaraldehyde and epoxy group at 40 °C was investigated, as well as the possibility of immobilized enzyme reuse in several consecutive cycles. After five consecutive cycles, dextransucrase immobilized on a glutaraldehyde-activated carrier (TiO2/5-ASA/GA) maintained almost 70 % of its initial expressed activity, while dextransucrase immobilized on the TiO2/GOPTMS carrier retained only 15 %. For GLOS synthesis, dextransucrase was immobilized into an agar-agar matrix, while disaccharide maltose was used as the acceptor molecule. Based on the results of the immobilization yield, a final agar-agar matrix concentration of 2 % proved to be the best for further work. The examination of mechanical properties, such as tensile strength, Young's modulus of elasticity and elongation at break, determined that 9:1 is the best ratio in which matrix (agar) and enzyme needed to be mixed up for immobilization. When the ratio of maltose to sucrose concentrations in the reaction mixture was 6:1, only one product, that is trisaccharide (panose), was formed. Immobilized dextransucrase showed considerable operational stability and retained approximately 50 % of the initial enzyme activity after after five consecutive application cycles.