Антибактеријска активност млека магарице балканске расе

Abstract

Млеко магарице је тек последњих година доспело у фокус научних истраживања, иако су његова благотоворна терапеутска и козметичка својства позната још од античких времена. Упркос томе што знање о функционалности млека магарице константно расте, његов антимикробни потенцијал остаје најмање истражен. Литературни подаци о микробиологији и евентуалној антимикробној активности млека магарице балканске расе која егзистира на подручју Србије и околних балканских земаља су јако лимитирани. Ово млеко се традиционално конзумира без претходне топлотне обраде, што покреће низ питања која се односе на здравствену безбедност конзумирања млека у сировом стању. Предмети истраживања ове докторске дисертације били су утврђивање микробиолошког квалитета сировог млека магарице балканске расе, као и испитивање његове антибактеријске активности према одабраним сојевима Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и Klebsiella pneumoniae. У циљу утврђивања главних носилаца антибактеријског дејства, као и самог модела антибактеријског деловања, у одабраним узорцима овог млека намењеним извођењу антибактеријских испитивања, извршено је одређивање садржаја антимикробних протеина - лизозима и лактоферина, као и садржаја калцијума. У узорцима млека магарице предвиђеним за испитивање антибактеријске активности према S. aureus и L. monocytogenes, одређен је садржај масних киселина са документованом антибактеријском активношћу према Грам позитивним бактеријама. Присуство L. monocytogenes и Salmonella spp. није утврђено ни у једном од 137 испитаних узорака сировог млека магарице, док је број E. coli, колиформних бактерија, Enterobacteriaceae, квасаца и плесни и суспектног B. cereus био испод границе детекције методе. Према резултатима добијеним у овој докторској дисертацији сви испитани узорци сировог млека магарице балканске расе су задовољавали захтеве европских регулатива 92/46/ЕЕC и EC 853/2004 и са микробиолошког аспекта су у потпуности били безбедни за директно конзумирање без претходне топлотне обраде. Сирово млеко магарице балканске расе је показало различиту антибактеријску активност према Грам позитивним и Грам негативним бактеријским сојевима тестираним у оквиру ове докторске дисертације, чији интензитет је зависио од нивоа контаминације узорака млека тестираним патогеном и температуре инкубирања. Температура инкубирања од +15 °C је у односу на +9 °C била генерално повољнија за активност антибактеријских супстанци у млеку магарице према свим тестираним патогенима, али је антибактеријски потенцијал узорака млека магарице на +15 °C био лимитиран бржим умножавањем испитаних бактерија на овој температури. То је посебно важило за узорке са већим нивоима контаминације (103 и 104 cfu/ml). Антибактеријска активност сировог млека магарице према L. monocytogenes и S. aureus се нa свим радним температурама састојала од продужeња лаг фазе и инхибирања бактеријског раста, док се у случају S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli АTCC 8739, E. coli АTCC 10536 и K. pneumoniae она огледала у редукцији њиховог почетног броја и/или продужењу лаг фазе. Резултати ове докторске дисертације су указали на калцијум зависну природу антибактеријске активности сировог млека магарице према S. Enteritidis, S. Typhimurium и оба тестирана соја E. coli. Најснажнију антибактеријску активност према K. pneumoniae показали су узорци млека магарице, који су поред великог садржаја лизозима имали и велики садржај лактоферина, па би у овом случају основни механизам антибактеријског деловања млека магарице могао бити синергизам лизозима и лактоферина. Лизозим је највероватније главни носилац антибактеријске активности млека магарице балканске расе, обзиром да је у односу на други антимикробни агенс – лактоферин у тестираним узорцима млека магарице детектован у вишеструко већој концентрацији. Известан допринос антибактеријској активности млека магарице балканске расе према L. monocytogenes и S. aureus могле би да дају и масне киселине са документованим антибактеријским дејством према Грам позитивним бактеријама (линолна, лауринска и олеинска киселина), које су у анализираним узорцима млека магарице у збиру чиниле од 40,3 до 54,7% од укупних масних киселина.

Mleko magarice je tek poslednjih godina dospelo u fokus naučnih istraživanja, iako su njegova blagotovorna terapeutska i kozmetička svojstva poznata još od antičkih vremena. Uprkos tome što znanje o funkcionalnosti mleka magarice konstantno raste, njegov antimikrobni potencijal ostaje najmanje istražen. Literaturni podaci o mikrobiologiji i eventualnoj antimikrobnoj aktivnosti mleka magarice balkanske rase koja egzistira na području Srbije i okolnih balkanskih zemalja su jako limitirani. Ovo mleko se tradicionalno konzumira bez prethodne toplotne obrade, što pokreće niz pitanja koja se odnose na zdravstvenu bezbednost konzumiranja mleka u sirovom stanju. Predmeti istraživanja ove doktorske disertacije bili su utvrđivanje mikrobiološkog kvaliteta sirovog mleka magarice balkanske rase, kao i ispitivanje njegove antibakterijske aktivnosti prema odabranim sojevima Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes i Klebsiella pneumoniae. U cilju utvrđivanja glavnih nosilaca antibakterijskog dejstva, kao i samog modela antibakterijskog delovanja, u odabranim uzorcima ovog mleka namenjenim izvođenju antibakterijskih ispitivanja, izvršeno je određivanje sadržaja antimikrobnih proteina - lizozima i laktoferina, kao i sadržaja kalcijuma. U uzorcima mleka magarice predviđenim za ispitivanje antibakterijske aktivnosti prema S. aureus i L. monocytogenes, određen je sadržaj masnih kiselina sa dokumentovanom antibakterijskom aktivnošću prema Gram pozitivnim bakterijama. Prisustvo L. monocytogenes i Salmonella spp. nije utvrđeno ni u jednom od 137 ispitanih uzoraka sirovog mleka magarice, dok je broj E. coli, koliformnih bakterija, Enterobacteriaceae, kvasaca i plesni i suspektnog B. cereus bio ispod granice detekcije metode. Prema rezultatima dobijenim u ovoj doktorskoj disertaciji svi ispitani uzorci sirovog mleka magarice balkanske rase su zadovoljavali zahteve evropskih regulativa 92/46/EEC i EC 853/2004 i sa mikrobiološkog aspekta su u potpunosti bili bezbedni za direktno konzumiranje bez prethodne toplotne obrade. Sirovo mleko magarice balkanske rase je pokazalo različitu antibakterijsku aktivnost prema Gram pozitivnim i Gram negativnim bakterijskim sojevima testiranim u okviru ove doktorske disertacije, čiji intenzitet je zavisio od nivoa kontaminacije uzoraka mleka testiranim patogenom i temperature inkubiranja. Temperatura inkubiranja od +15 °C je u odnosu na +9 °C bila generalno povoljnija za aktivnost antibakterijskih supstanci u mleku magarice prema svim testiranim patogenima, ali je antibakterijski potencijal uzoraka mleka magarice na +15 °C bio limitiran bržim umnožavanjem ispitanih bakterija na ovoj temperaturi. To je posebno važilo za uzorke sa većim nivoima kontaminacije (103 i 104 cfu/ml). Antibakterijska aktivnost sirovog mleka magarice prema L. monocytogenes i S. aureus se na svim radnim temperaturama sastojala od produženja lag faze i inhibiranja bakterijskog rasta, dok se u slučaju S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli ATCC 8739, E. coli ATCC 10536 i K. pneumoniae ona ogledala u redukciji njihovog početnog broja i/ili produženju lag faze. Rezultati ove doktorske disertacije su ukazali na kalcijum zavisnu prirodu antibakterijske aktivnosti sirovog mleka magarice prema S. Enteritidis, S. Typhimurium i oba testirana soja E. coli. Najsnažniju antibakterijsku aktivnost prema K. pneumoniae pokazali su uzorci mleka magarice, koji su pored velikog sadržaja lizozima imali i veliki sadržaj laktoferina, pa bi u ovom slučaju osnovni mehanizam antibakterijskog delovanja mleka magarice mogao biti sinergizam lizozima i laktoferina. Lizozim je najverovatnije glavni nosilac antibakterijske aktivnosti mleka magarice balkanske rase, obzirom da je u odnosu na drugi antimikrobni agens – laktoferin u testiranim uzorcima mleka magarice detektovan u višestruko većoj koncentraciji. Izvestan doprinos antibakterijskoj aktivnosti mleka magarice balkanske rase prema L. monocytogenes i S. aureus mogle bi da daju i masne kiseline sa dokumentovanim antibakterijskim dejstvom prema Gram pozitivnim bakterijama (linolna, laurinska i oleinska kiselina), koje su u analiziranim uzorcima mleka magarice u zbiru činile od 40,3 do 54,7% od ukupnih masnih kiselina.

Donkey's milk has recently become a very popular topic among scientific community although it has been used for therapeutic and cosmetic purposes since ancient times. Even though the number of investigations concerning donkey's milk functionality has increased, the studies on its antimicrobial potential are limited. Especially, there is a lack in literature data on microbiological quality and antibacterial activity of donkey's milk obtained from Domestic Balkan breed originated in Serbia and other countries in Balkan region. The fact that this milk is traditionally consumed without heat treatment launches a series of issues concerning its safety. The aim of this thesis was to determine microbiological quality of Domestic Balkan donkey's milk, as well as to investigate its antibacterial activity against the selected strains of Escherichia coli, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Klebsiella pneumonia. In order to determine the major antibacterial substances, as well as the model of antibacterial activity, the content of antimicrobial proteins (lysozyme and lactoferrin) and calcium was determined. The amount of fatty acids which are known to be effective against Gram-positive bacteria was determined in milk samples tested for antibacterial activity against S. aureus и L. monocytogenes. The presence of L. monocytogenes and Salmonella spp. was not detected in any of the 137 raw donkey's milk samples, while the levels of E. coli, coliform bacteria, Enterobacteriaceae, yeast and molds and suspect Bacillus cereus were below the limit of detection of the assays. According to obtained results, all examined Domestic Balkan donkeys' raw milk samples were in accordance with the EU regulations 92/46/ЕЕC and EC 853/2004 in terms of their microbiological quality, thus being completely safe for direct consumptions, without thermal treatment. Raw Domestic Balkan donkey's milk has expressed different antibacterial activities against Gram-positive and Gram-negative bacteria strains tested in this thesis, with the intensities which depended on contamination level and incubation temperature. In comparison to temperature of +9 °C, the incubation temperature of +15 °C was more favourable for activity of antibacterial substances in donkey's milk against all tested pathogens. However, the antibacterial potential of donkey's milk samples at +15 °C was limited with rapid multiplication of bacteria at this temperature. This was especially pronounced in samples characterized with higher contamination levels (103 and 104 cfu/ml). Antibacterial activity of raw donkey's milk against L. monocytogenes and S. aureus at all tested temperatures reflected in prolonged lag phase and inhibition of bacterial growth, while the activity against S. Enteritidis, S. Typhimurium, E. coli АTCC 8739, E. coli АTCC 10536 and K. pneumonia comprised reduction of initial bacterial numbers and/or prolongation of lag phase. Results obtained in this thesis have indicated on calcium dependent antibacterial activity of raw donkey's milk against S. Enteritidis, S. Typhimurium and both E. coli strains. The most pronounced antibacterial activity against K. pneumonia was found in donkey's milk samples which besides high content of lysozyme had high content of lactoferrin, thus indicating that the basic antibacterial mechanism of donkey's milk might be the synergism between lysozyme and lactoferrin. Lysozyme was probably the substance with the highest antimicrobial activity in Domestic Balkan donkey's milk, since it was detected in significantly higher concentrations than lactoferrin. The fatty acids which are known to be effective against Gram-positive bacteria (linoleic, lauric and oleic) and which comprised from 40.3 to 54.7% of total fatty acids in tested samples, may also contribute to antimicrobial activity of Domestic Balkan donkey's milk against L. monocytogenes and S. aureus.