Филогенетска анализа гена, развојна, ткивна и полна дистрибуција глутатион-ѕ-трансфераза рибе зебрице - функционална карактеризација одабраних рекомбинантних протеина

Abstract

Глутатион-S-трансферазе (GST) припадају вишефункционалној суперпородици ензима и имају разноврсне каталитичке улоге у организму, са основном функцијом конјугације редукованог глутатиона са разноврсним ксенобиотицима у циљу смањења њихове токсичности. Улога Gst у процесу детоксификације код риба је препозната током 1970-их година, али према доступној литератури, само је неколико рибљих ензима Gst функционално окарактерисано. У овој дисертацији урађена је свеобухватна карактеризација ензимске суперпородице Gst зебрица (лат. Danio rerio), важном кичмењачком модел организму, са циљем бољег разумевања диверзификације и еволуције, физиолошког значаја и улоге ензима Gst као биомаркера изложености одређеним хемикалијама. Комбинацијом биоинформатичких метода, анализом експримирања гена, експримирањем и пречишћавањем рекомбинтантних протеина и применом ензимских тестова и тестирањем инхибиторног потенцијала различитих супстанци урађена је филогенетска анализа, развојна, ткивна и полна дистрибуција иРНК гена gst зебрице и функционална карактеризација одабраних рекомбинантних протеина (Gstr1, Gstt2 и Gstm3). Филогенетска анализа је открила 27 чланова суперпородице gst у геному зебрице, подељених у 9 класа. Развојнa, ткивнa и полнa дистрибуција иРНК, као и функционална сличност са хуманим ортолозима, указујe да су представници класа Pi, Theta, Zeta и Rho значајни у процесима биотрансформације ксенобиотика, и да потенцијално могу имати кључну улогу у одређеним физиолошким процесима. Резултати указују на могућу улогу Gstr1 у стероидогенези, метаболизму и/или физиолошкој активности андрогена код риба, насупрот изостанку овакве функције према естрогенима, као и заштити риба од штетних загађивача из спољашње средине, као што су органофосфорни инсектициди и лекови.

Glutathione-S-transferases (GSTs) are a superfamily of multifunctional proteins which have diverse roles. Their primary function is a conjugation of reduced glutathione to a variety of xenobiotics in order to alleviate their toxicity. The role of Gsts in the detoxification process in fish was recognized since the 1970s. According to literature, only a few fish Gst enzymes have been functionally characterized. Here, a comprehensive characterization of GSTs in zebrafish (Danio rerio), an important model organism, was made in order to better understand the diversification and evolution, the physiological significance, as well as the role of the Gsts as a biomarker of xenobiotic exposure. A combination of bioinformatic methods, gene expression analysis, purification of recombinant proteins, enzymatic tests and analysis of the inhibitory potential of various compounds was conducted to reveal phylogeny, developmental-, tissue- and sex-dependent distribution of the zebrafish gst mRNA and functional characterization of selected recombinant proteins (Gstr1, Gstt2, Gstm3). A detailed phylogenetic analysis revealed 27 gst genes, divided into 9 classes. The developmental-, tissue- and sex-dependent distribution of mRNA and functional similarity with human orthologs, indicated that representatives of the classes Pi, Theta, Zeta, and Rho are important in the biotransformation of xenobiotics. Gsts potentially key role in certain physiological processes was revealed. The results indicated a possible role of Gstr1 in the steroidogenesis, metabolism and/or physiological activity of androgens in fish, as opposed to the absence of such function for estrogen, as well as its role in the protection of fish from harmful environmental pollutants, like organophosphorus insecticides and drugs.