Ispitivanje uloge kalcijumovih kanala T-tipa u animalnom modelu postincinzionog bola

Abstract

Svrha studije: T-tip kalcijumovih kanala (T-kanal) je uključen u regulaciju neuronske ekscitabilnosti kako u fiziološkim, tako i u patološkim uslovima, kao što su epilepsija i hronični bol. Poznato je da antagonisti T-kanala, uključujući i neurosteroide i njihove sintetske analoge, ublažavaju neuropatski bol. Ipak, uloga Tkanala nije ispitana u akutnom hirurškom modelu bola. Stoga je cilj našeg rada bio da se ispita: 1) pojava hiperekscitabilnosti senzornih neurona spinalnih gangliona i promene u biofizičkim karakteristikama T-kanala u postincizionom modelu bola, 2) antinociceptivni efekat antagonista T-kanala (TTA-P2, epipregnanolona i njegovog sintetskog analoga 3β-OH) u postincizionom modelu bola, 3) uticaj antinociceptivnih doza antagonista T-kanala na motornu spretnost eksperimentalnih životinja. Metode: Kao model postoperativnog bola korišćen je postincizioni model bola u miševa i pacova. U ovom modelu bola hiperalgezija je merena u testovima termičke i mehaničke nocicepcije. In vivo ispitivanje uloge T-kanala u razvoju nocicepcije u postincizionom modelu bola izvršeno je u miševa kod kojih je globalno obrisan gen za CaV3.2 kalcijumov kanal (CaV3.2 KO), kao i u normalnih miševa (WT). Svi in vitro eksperimenti u ovom modelu bola izvršeni su na telima disociranih senzornih neurona spinalnih gangliona. Promene u ekscitabilnosti, uticaj T-kanala na hiperekscitabilnost senzornih neurona, kao i promene u biofizičkim karakteristikama T-kanala su ispitane elektrofiziološkom metodom na celim ćelijama. qRT-PCR, imunoblot i imunohistohemijska metoda su korišćene za ispitivanje promena u ćelijskoj ekspresiji T-kanala. Uticaj post-translacionih modifikacija na funkcionalnost T-kanala ispitan je primenom metode imunoblotova u cilju utvrđivanja promena u ekspresiji USP5 enzima, zaduženog za deubikvitinaciju CaV3.2 podtipa T-kanala. Uloga USP5 enzima ispitana je u bihejvioralnim testovima na pacovima i miševima kod kojih je privremeno sprečena produkcija USP5 enzima primenom shRNK-USP5 pre sprovođenja incizije...