Преваленца и молекуларна типизација зоонотског паразита Blastocystis sp. код свиња са територије Војводине

Abstract

Blastocystis је паразитска протозоа гастроинтестиналног тракта која се виђа код људи и мноштва животиња. Паразит има светску дистрибуцију и представља веома чест налаз у различитим паразитолошким испитивањима. Иако је прошло више од 100 година од када је Blastocystis први пут описан, и поред напора бројних истраживача још увек постоје бројне непознанице око овог микроорганизма. Нека од најважнијих питања јесу да ли Blastocystis узрокује обољења људи и која је улога животиња, односно контакта човек-животиња у епидемиологији инфекције код људи. Све већи број података из епидемиолошких, in-vivo и in-vitro студија јасно указује на Blastocystis као патогени микроорганизам. У природи постоји мноштво генотипова, а новија запажања указују да су људи домаћини великог броја зоонотских генотипова. Изолати Blastocystis sp. су сврстани у генетске варијетете, односно суптипове (ST) од 1-17, на основу молекуларне карактеризације. Висока преваленца овог паразита код свиња и присуство суптипова ST5, али и ST1 и ST3 може бити доказ да су свиње природни резервоар инфекције и да могу бити добар модел у истраживању патогенезе инфекције код људи. Са епидемиолошког аспекта, блиски контакт људи и свиња, било да је реч о интензивном узгоју или малим сеоским домаћинствима, представља ризик у смислу зоонотске трансмисије бластоцистиса. Ова дисертација представља прву епидемиолошку студију о преваленци и молекуларној карактеризацији зоонотског паразита Blastocystis sp. код свиња са територије Србије. У циљу процене преваленце Blastocystis sp. код свиња са територије Војводине, укупно је сакупљено 403 индивидуална узорка фецеса свиња. Узорковање је извршено на укупно 10 фарми за интензивни узгој свиња. Узорци су били распоређени пропорционално броју свиња одређене категорије. Од свих узорака су припремљени нативни размази, који су прегледани светлосним микроскопом. За умножавање паразита у циљу лакше лабораторијске дијагностике примењена је ксенична (не-стерилна) метода in vitro култивације. Све културе су такође прегледане светлосним микроскопом. ДНК је изолована из 48 насумице одабраних узорака у циљу упоређивања перформанси различитих дијагностичких приступа. За 38 насумично одабраних узорака, који су били позитивни при in vitro култивацији, урађена је суптипизација са STS прајмерима специфичним за суптипове очекиване код свиња: ST1, ST2, ST3 и ST5. Нативним прегледом је Blastocystis sp. идентификован у 41,69% узорака, док је култивацијом паразит установљен у 70,22% узорака. Blastocystis је пронађен код свих категорија свиња, на свих десет фарми. Приликом упоређивања традиционалних паразитолошких дијагностичких поступака и молекуларне дијагностике, установљена је осетљивост директног микроскопског прегледа од 46,15%, односно in vitro култивације од 84,62%. При молекуларној суптипизацији од 38 узорака, који су били позитивни у култури у 25 узорака смо установили најмање један од тражених суптипова. У закључку, установљена висока преваленца бластоцистиса код свиња из интензивног узгоја, потврђује улогу свиња као природних резервоара ове зоонотске протозое. Потврђена је хипотеза да су свиње резервоар одређених зоонотских суптипова Blastocystis sp. и да представљају фактор ризика у ширењу инфекције на људе. У највећем броју узорака установљено је присуство суптипа ST1, који је један од најчешће доказаних суптипова код људи. На другом месту по заступљености је био суптип ST5, који представља ризик по људе који су у непосредном свакодневном контакту са свињама, као што су радници на фармама и кланицама. Суптип ST3 који се најчешће доводи у везу са синдромом иритабилног колона (ИБС) је био присутан у 24% узорка, који су били успешно типизирани. Један од закључака ове дисертације је и да су дијагностичке перформансе in vitro култивације и молекуларних техника у дијагностици Blastocystis sp. код свиња супериорне у односу на традиционални и опште прихваћен нативни преглед фекалног материјала.

Blastocystis je parazitska protozoa gastrointestinalnog trakta koja se viđa kod ljudi i mnoštva životinja. Parazit ima svetsku distribuciju i predstavlja veoma čest nalaz u različitim parazitološkim ispitivanjima. Iako je prošlo više od 100 godina od kada je Blastocystis prvi put opisan, i pored napora brojnih istraživača još uvek postoje brojne nepoznanice oko ovog mikroorganizma. Neka od najvažnijih pitanja jesu da li Blastocystis uzrokuje oboljenja ljudi i koja je uloga životinja, odnosno kontakta čovek-životinja u epidemiologiji infekcije kod ljudi. Sve veći broj podataka iz epidemioloških, in-vivo i in-vitro studija jasno ukazuje na Blastocystis kao patogeni mikroorganizam. U prirodi postoji mnoštvo genotipova, a novija zapažanja ukazuju da su ljudi domaćini velikog broja zoonotskih genotipova. Izolati Blastocystis sp. su svrstani u genetske varijetete, odnosno suptipove (ST) od 1-17, na osnovu molekularne karakterizacije. Visoka prevalenca ovog parazita kod svinja i prisustvo suptipova ST5, ali i ST1 i ST3 može biti dokaz da su svinje prirodni rezervoar infekcije i da mogu biti dobar model u istraživanju patogeneze infekcije kod ljudi. Sa epidemiološkog aspekta, bliski kontakt ljudi i svinja, bilo da je reč o intenzivnom uzgoju ili malim seoskim domaćinstvima, predstavlja rizik u smislu zoonotske transmisije blastocistisa. Ova disertacija predstavlja prvu epidemiološku studiju o prevalenci i molekularnoj karakterizaciji zoonotskog parazita Blastocystis sp. kod svinja sa teritorije Srbije. U cilju procene prevalence Blastocystis sp. kod svinja sa teritorije Vojvodine, ukupno je sakupljeno 403 individualna uzorka fecesa svinja. Uzorkovanje je izvršeno na ukupno 10 farmi za intenzivni uzgoj svinja. Uzorci su bili raspoređeni proporcionalno broju svinja određene kategorije. Od svih uzoraka su pripremljeni nativni razmazi, koji su pregledani svetlosnim mikroskopom. Za umnožavanje parazita u cilju lakše laboratorijske dijagnostike primenjena je ksenična (ne-sterilna) metoda in vitro kultivacije. Sve kulture su takođe pregledane svetlosnim mikroskopom. DNK je izolovana iz 48 nasumice odabranih uzoraka u cilju upoređivanja performansi različitih dijagnostičkih pristupa. Za 38 nasumično odabranih uzoraka, koji su bili pozitivni pri in vitro kultivaciji, urađena je suptipizacija sa STS prajmerima specifičnim za suptipove očekivane kod svinja: ST1, ST2, ST3 i ST5. Nativnim pregledom je Blastocystis sp. identifikovan u 41,69% uzoraka, dok je kultivacijom parazit ustanovljen u 70,22% uzoraka. Blastocystis je pronađen kod svih kategorija svinja, na svih deset farmi. Prilikom upoređivanja tradicionalnih parazitoloških dijagnostičkih postupaka i molekularne dijagnostike, ustanovljena je osetljivost direktnog mikroskopskog pregleda od 46,15%, odnosno in vitro kultivacije od 84,62%. Pri molekularnoj suptipizaciji od 38 uzoraka, koji su bili pozitivni u kulturi u 25 uzoraka smo ustanovili najmanje jedan od traženih suptipova. U zaključku, ustanovljena visoka prevalenca blastocistisa kod svinja iz intenzivnog uzgoja, potvrđuje ulogu svinja kao prirodnih rezervoara ove zoonotske protozoe. Potvrđena je hipoteza da su svinje rezervoar određenih zoonotskih suptipova Blastocystis sp. i da predstavljaju faktor rizika u širenju infekcije na ljude. U najvećem broju uzoraka ustanovljeno je prisustvo suptipa ST1, koji je jedan od najčešće dokazanih suptipova kod ljudi. Na drugom mestu po zastupljenosti je bio suptip ST5, koji predstavlja rizik po ljude koji su u neposrednom svakodnevnom kontaktu sa svinjama, kao što su radnici na farmama i klanicama. Suptip ST3 koji se najčešće dovodi u vezu sa sindromom iritabilnog kolona (IBS) je bio prisutan u 24% uzorka, koji su bili uspešno tipizirani. Jedan od zaključaka ove disertacije je i da su dijagnostičke performanse in vitro kultivacije i molekularnih tehnika u dijagnostici Blastocystis sp. kod svinja superiorne u odnosu na tradicionalni i opšte prihvaćen nativni pregled fekalnog materijala.

Blastocystis is a common protist colonizing the gastrointestinal tract of humans and various animals. This parasite has a worldwide distribution and presents a frequent finding in different parasitological surveys. Blastocystis has been described for the first time over a century ago, but despite the efforts of many researchers, there are still many unknowns about this microorganism. Some of the most important questions are whether Blastocystis causes disease in humans and what is the role of animals or the animal-human contact in the epidemiology of human blastocystosis. An increasing number of data from epidemiological, in-vivo and in-vitro studies clearly suggests that Blastocystis is a pathogenic microorganism. In the nature several genotypes exist and contemporary observations are suggesting that humans are hosts for a large number of zoonotic genotypes. Based on molecular characterization, isolates of Blastocystis sp. are classified into genetic variants, so called subtypes (ST) from 1 to 17. High prevalence of this parasite in pigs and the presence of subtypes ST5, ST1 and ST3 suggests that that pigs are a natural reservoir of infection and can be a good model in studying the pathogenesis of infection in humans. The close contact of humans and pigs, whether we speak about intensive farming or small rural households, represents a substantial risk of zoonotic transmission of Blastocystis. This thesis presents the first epidemiological study on prevalence and molecular characterization of zoonotic parasite Blastocystis sp. in pigs from Serbia. In order to assess the prevalence of Blastocystis sp. in pigs from Vojvodina province, a total of 403 individual faecal samples were collected. Samples were collected from 10 intensive growing systems. Samples were taken at random and proportionate to each production category of pigs. Direct wet mounts were made from all samples and examined under a microscope. Xenic (non sterile) in vitro cultivation was used for multiplication and easier diagnosis of the parasite. All cultured samples were also examined under a light microscope. DNA was extracted from 48 randomly selected samples for the purpose of comparison of different diagnostic approaches. 38 randomly selected culture positive samples were subjected to subtyping with STS primer sets for subtypes expected in pigs: ST1, ST2, ST3 and ST5. Blastocystis sp. was present in 168 samples when wet mount preparations were analyzed under the microscope, indicating a prevalence of 41.69%. 283 samples were culture positive indicating a prevalence of 70.22%. Blastocystis was found in all the farms included in the study and at all categories of pigs. When we compared the performances of PCR and traditional parasitological techniques the estimated sensitivity of direct wet mount was 46.15%, while the sensitivity of in vitro cultivation was 84.62%. From 38 randomly selected culture positive samples we identified one of the sought subtypes (ST1-ST3 and ST5) in 25 samples. In conclusion, the high prevalence of Blastocystis in pigs from intensive growing systems confirms the role of pigs as natural reservoirs of this zoonotic parasite. As hypothesized, our investigation showed the presence of all sought subtypes. ST1 was the predominant subtype, present in 96% (24/25) of samples in which we identified Blastocystis with STS primers. ST1 is one of the subtypes most commonly reported in humans, thus a high incidence of this subtype in pigs should not be neglected when we try to evaluate the zoonotic potential. ST5 was identified in 64% samples. ST5 as a potential zoonotic subtype has a significance in industrial swine production, were increased risk of zoonotic transmission exists. ST3 was identified in 24% of samples. This subtype is frequently associated with irritable bowel syndrome (IBS). One of the conclusions of this thesis is that diagnostic performances of in vitro cultivation and molecular techniques in diagnosis of Blastocy