Analiza efekta povećane ekspresije SOX2 gena na održavanje pluripotentnosti, proliferaciju i neuralnu diferencijaciju embrionalnih karcinomskih NT2/D1 ćelija

Abstract

SOX2 transkripcioni faktor predstavlja univerzalni marker pluripotentnih matičnih ćelija. Ovaj faktor poseduje značajne uloge tokom embrionalnog razvića kičmenjaka i jedan je od ključnih regulatora neuralne diferencijacije. Takođe, SOX2 transkripcioni faktor u različitim ćelijama promoviše ili reprimira ćelijsku proliferaciju. NT2/D1, pluripotentna embrionalna karcinomska ćelijska linija koja vodi poreklo od malignog testikularnog teratokarcinoma, je slična ranim embrionalnim matičnim ćelija. U prisustvu retinoične kiseline ove ćelije se diferenciraju u različite tipove ćelija, uključujući i zrele neurone. Imajući u vidu značajnu ulogu SOX2 gena u održavanju pluripotentnosti, proliferaciji i neuralnoj diferencijaciji, u ovoj disertaciji analiziran je uticaj povećane ekspresije ovog gena na ekspresiju markera pluripotentnosti, proliferaciju i neuralnu diferencijaciju NT2/D1 ćelija. Stabilnom transfekcijom NT2/D1 ćelija SOX2/pcDNA3.1 konstruktom generisana su dva ćelijska klona sa povećanom ekspresijom SOX2 gena (klonovi su označeni kao F5 i G3). Ovom metodom generisana su i tri NT2/D1 ćelijska klona sa inducibilnom ekspresijom SOX2 gena kod kojih je ekspresija ovog gena regulisana različitih koncentracija doksiciklina (klonovi su označeni kao E2, H9 i I7). Rezultati semi- kvantitativnog RT-PCR- a ukazuju da povećana ekspresija SOX2 gena dovodi do promene ekspresije ključnih markera pluripotentnosti (OCT4 i NANOG). Takođe, NT2/D1 ćelijski klonovi sa povećanom ekspresijom SOX2 gena (F5 i G3) ulaze u neuralnu diferencijaciju indukovanu retinoičnom kiselinom čak i u uslovima povećane ekspresije SOX2 gena. Tretman retinoičnom kiselinom u trajanju od tri nedelje doveo je do povećanja ekspresije markera neuralne diferencijacije (neuroD1 i sinaptofizin) kod NT2/D1 ćelijskih klonova sa povećanom ekspresijom SOX2 gena u poređenju sa ekspresijom ovih markera detektovanom kod tretiranih NT2/D1 ćelija. Testom za određivanje proliferativnog kapaciteta ćelija (MTT testom) je pokazano da je stopa rasta G3 ćelijskog klona povećana približno 1,3 puta u poređenju sa stopom rasta NT2/D1 ćelija. U ovoj disertaciji su po prvi put prikazani rezultati koji pokazuju da povećana ekspresija SOX2 gena kod NT2/D1 ćelija dovodi do promene ekspresije ključnih markera pluripotentnosti, do promene proliferacije ovih ćelija, kao i do promene ekspresije markera neuralne diferencijacije nakon tri nedelje tretmana retinoičnom kiselinom.

SOX2, an universal marker of pluripotent stem cells, is a transcription factor that plays significant roles during embryonic development in vertebrates and it is one of the key regulators of neural differentiation. Furthermore, in different cellular contexts this transcription factor represses or promotes proliferation. NT2/D1, pluripotent embryonal carcinoma cell line originating from malignant testicular teratocarcinomas, resembles early embryonic stem cells. In the presence of retinoic acid, these cells differentiate into various cell types, including mature neurons. Given the critical role of SOX2 transcription factor in regulation of pluripotency, cell proliferation and neural differentiation, our aim has been to analyze effects of SOX2 overexpression on expression of key pluripotency genes, cell proliferation and expression of neural markers during retinoic acid treatment of NT2/D1 cell line. Two SOX2-overexpressing NT2/D1 cell clones (designated as F5 and G3) have been generate by stable transfection using SOX2/pcDNA3.1 expression construct. Furthermore, we have generated three inducible SOX2-overexpressing NT2/D1 cell clones (designated as E2, H9 and I7) in which SOX2 expression is regulated by various concentrations of doxycycline. Results of semi-quantitative RT-PCR analysis demonstrated that SOX2 overexpression in NT2/D1 cell clones resulted in altered expression of key pluripotency genes OCT4 and NANOG. Furthermore, SOX2-overexpressing NT2/D1 cell clones (F5 and G3 cell clones) are able to enter into RA-dependent neural differentiation even in the presence of elevated SOX2 expression. It is shown that upon three weeks of treatment by retinoic acid, expression of neural markers (neuroD1 and synaptophysin) is higher in treated cell clones compared to treated parental NT2/D1 cells. In addition, results of cell proliferation assay (MTT test) demonstrated higher growth rate of G3 cell clone compared to the growth rate of parental cells. By data presented here, for the first time, we demonstrated that SOX2 overexpression in NT2/D1 cell line resulted in altered expression of pluripotency-related genes and proliferation rate and in altered expression of neural markers after three weeks of treatment by retinoic acid.