Примена електронске парамагнетне резонантне спектроскопије за испитивање коформационих промена албумина методом спинског обележавања

Abstract

Серумски албумин је најзаступљенији протеин у крвној плазми, који има више важних физиолошких функција, због чега је детаљно проучаван разним техникама. Једна од техника коришћених за проучавање конформационих промена албумина и његовог капацитета за везивање разних супстанција је електронска парамагнетна резонантна (ЕПР) спектроскопија у спрези са спинским обележавањем. У ту сврху је коришћено неколико различитих спинских обележивача, међу којима су спински обележене масне киселине, с обзиром на то да је албумин главни транспортер масних киселина. Други често коришћени обележивач је 3-малеимидо проксил (5-МСЛ) који се ковалентно везује за слободан цистеин. У овој докторској дисертацији две спински обележене стеаринске киселине које садрже парамагнетну доксил групу (група од које потиче ЕПР сигнал) на петом (5-доксил стеаринска киселина, 5-ДС) и на шеснаестом (16-доксил стеаринска киселина, 16-ДС) угљениковом атому метиленског ланца су коришћене за проучавање конформационих промена у хуманом серумском албумину (ХСА). Осим тога, конфомационе промене у говеђем серумском албумину (БСА) су проучаване обележавањем БСА са 5-МСЛ. Конформационе промене су биле индуковане варирањем температуре и pH, додавањем етанола, везивањем неколико лиганада типичних за албумин (масне киселине и лекови) и излагањем дејству јаких оксидујућих агенаса, водоник-пероксиду и супероксидном анјонском радикалу. Додатни циљ ове дисертације је био да се испита да ли 5-МСЛ може да се користи за детекцију суптилних конформационих промена узрокованих везивањем лиганада, с обзиром на то да се 5-МСЛ налази у ригидној средини када се веже за једини слободан цистеин у БСA који се налази на позицији 34 у аминокиселинској секвенцији (Cys-34). Резултати ове дисертације показују да су доксил групе обележивача 5-ДС и 16-ДС (које дају информације о променамa у својој околини), лоциране на различитим местима у ХСА. Наиме, доксил група 5-ДС се налази у хидрофобној унутрашњости ХСА, док је за 16-ДС лоцирана близу површине ХСА или чак пролази кроз њу. Стога, ова два једињења дају информације са различитих места на молекулу ХСА. Такође је уочено да ЕПР спектри оба ДС обележивача везаних за ХСА могу да се разложе на компоненте које одговарају јако (ЈВ), слабо везаном (СВ) и невезаном (НВ) обележивачу. За 5-МСЛ везан за БСА, показано је да се ЕПР спектри састоје из две компоненте, ЈВ и СВ, које потичу од 5-МСЛ везаног за Cys-34 и амино групе, респективно...

Serum albumin is the most abundant blood plasma protein, which has been thoroughly studied using a plethora of techniques, due to its multiple important physiological roles. One of the methods used to monitor albumin conformational changes and binding capacity is electron paramagnetic resonance (EPR) spin-labeling methodology. For this purpose, albumin has been studied using various spin-labels, among which spin-labeled fatty acids have been the most commonly employed, since albumin is the main carrier of fatty acids. The other frequently used spin-label is 3- maleimido-proxyl (5-MSL) which binds covalently to the free cysteine residues. In this doctoral dissertation, two spin-labeled stearic acids containing a paramagnetic doxyl group (the EPR-active group) attached at fifth (5-doxyl-stearic acid, 5-DS) and sixteenth (16-doxyl stearic acid, 16-DS) carbon atom of the methylene chain, were used to study the conformational changes of human serum albumin (HSA). Furthermore, conformational changes of bovine serum albumin (BSA) were studied by labeling BSA with 5-MSL. The conformational changes were induced by varying temperature and pH, addition of ethanol, binding several typical ligands (fatty acids and drugs) and exposure to strong oxidizing agents, hydrogen peroxide and superoxide anion radical. The additional goal of this dissertation was to reveal whether 5-MSL can be used to track subtle conformational changes arising from ligand binding, since 5- MSL is located in the fairly rigid environment when bound to the single free cysteine residue in BSA, located at the position 34 in amino acid sequence (Cys-34). The results from this study show that the doxyl groups (group which reports the changes in its environment) of 5-DS and 16-DS, are located at different sites in HSA. Namely, doxyl group of 5-DS is located in the hydrophobic interior, while for 16-DS it is close to, or even protrudes the surface of HSA. Hence, these two compounds give information from the different locations in HSA molecule. It was also observed that EPR spectra of both DS spin-labels bound to HSA could be decomposed into components corresponding to the strongly (SB), weakly bound (WB) and unbound (UB) label. In case of 5-MSL bound to BSA, it was shown that the corresponding EPR spectra consist of SB and WB component which originate from 5-MSL bound to Cys-34 and amino groups, respectively...