Утицај реактивних врста кисеоника на активност mTOR сигналног пута код пацијената са мијелопролиферативним неоплазмама

Abstract

Заједничка карактеристика малигнитета је повећана концентрација реактивних врста кисеоника (ROS) и реактивних врста азота (RNS) које могу да проузрокују оштећења макромолекула у ћелији и доведу до нарушавања њене структуре и функције. Оксидативно оштећење ДНК сматра се иницијалним догађајем у развоју канцерогенезе. ROS утичу на функцију хематопоетских матичних ћелија, доводе до промена ћелијског циклуса, убрзаног старења ћелија или до настанка хематолошких малигнитета. BCR/ABL онкоген и JAK2V617F мутација индукују стварање ROS у хематопоетским матичним ћелијама што води геномској нестабилности и оштећењу ДНК. Под утицајем ЈАК2V617F мутације и BCR/ABL онкогена код хроничних мијелопролиферативних неоплазми (ХМН) долази до конститутивне активације PI3K/AKT/mTOR сигналног пута, који регулише метаболизам и стимулише раст и пролиферацију ћелија. С обзиром да ROS и RNS могу утицати на активност mTOR киназе, испитани су параметри антиоксидативне заштите и оксидативно измењених липида и протеина у циркулацији, као и степен активације AKT/mTOR сигналног пута у гранулоцитима болесника са ХМН и хуманој еритролеукемијској ћелијској линији (енг. Human erythroleukemia cell line, HEL) са ЈАК2V617F мутацијом. Методе: У студију je укључено 110 de novo ХМН болесника: 30 са полицитемијом вером (ПВ), 24 са есенцијалном тромбоцитемијом (ЕТ), 34 са примарном мијелофиброзом (ПМФ), 22 болесника са дијагнозом хроничне мијелоидне леукемије (ХМЛ) и 10 здравих испитаника. Маркери оксидативног и нитрозативног стреса у плазми и лизатима еритроцита одређени су колориметријском методом. Количина интрацелуларне продукције ROS одређенa је употребом флуорогеног реагенса H2DCF-DA. Ниво нитротирозина, индуцибилне NO синтазе (iNOS) и степен активације АKT/mTOR/p70S6K киназа одређени су у гранулоцитима болесника са ХМН имуноцитохемијском методом и методом имуноблота. У in vitro условима испитан је утицај водоник пероксида (H2O2) и N- ацетил цистеина на активацију mТОR и експресију iNOS и нитротирозина. Утицај два различита оксиданса, H2O2 и 2,2'-азобис(2-амидинопропан) дихидрохлорида (AAPH), на активацију AKT/mTOR сигналног пута, преживљавање и ћелијски циклус HEL ћелија, у in vitro условима, испитан је методом имуноблота, FACS методом и МТТ тестом...

common characteristic of malignancies is an increase of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). In such circumstances macromolecules are damaged and the cell structure and function are disrupted. The oxidative DNA damage is considered to be the initial event in the developement of carcinogenesis. ROS affects the function of hematopoietic stem cells, changes the cell cycle progression, accelerаtes aging and induces hematological malignancies. The BCR/ABL oncogene and JAK2V617F mutation induces the formation of ROS in hematopoietic stem cells that leads to genomic instability and DNA damage. In the myeloproliferative neoplasm (MPN) patients, JAK2V617F mutation and BCR/ABL oncogene are associated with the constitutive activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway, which stimulates the growth and proliferation of cells. As ROS and RNS may affect the activity of mTOR, we have examined the parameters of antioxidant protection and oxidative damage of lipids and proteins in circulation as well as the AKT/mTOR signaling pathway activity in the MPN granulocytes and human erythroleukemia (HEL) cell line with JAK2V617F mutation. Methods: The study includes 110 de novo MPN patients: 30 polycythemia vera (PV), 24 essential thrombocythemia (ET), 34 primary myelofibrosis (PMF) as well as 22 patients with the diagnosis of chronic myeloid leukemia (CML) and 10 healthy subjects. Markers of oxidative and nitrosative stress in plasma and erythrocyte lysates were determined by the colorimetric method. The intracellular production of ROS was determined by fluorogenic reagent H2DCF-DA. The levels of nitrotyrosine, inducible NO synthase (iNOS) and the activation rate of AKT/mTOR/p70S6K kinases were determined in granulocytes of MPN patients using immunocytochemistry and immunoblotting methods. The influence of hydrogen peroxide (H2O2) and 2, 2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) oxidants on AKT/mTOR signal pathway, cell cycle and survival were tested by Western blot, FACS and MTT test in HEL cells...