Alkoholna fermentacija melase i gustog soka šećerne repe pomoću imobilisanih ćelija Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Proizvodnja bioetanola iz među- i nusproizvoda procesa prerade šećerne repe, može imati pozitivan uticaj na regionalnu ekomomiju i socio-ekonomski razvoj u zemljama sa razvijenom industrijom konzumnog šećera, kao što je Srbija. Kao proizvodni mikroorganizam u proizvodnji etanola u najvećoj meri se koristi kvasac Saccharomyces cerevisiae. Primena imobilisanih ćelija kvasca u fermentaciji podloga sa visokom sadržajem šećera (iznad 250 g/l), tzv. VHG fermentacija, je često izučavana sa ciljem povećanja efikasnosti proizvodnje etanola. U ovom radu su ćelije S. cerevisiae imobilisane na različitim novim nosačima: presovanim rezancima šećerne repe (PRŠR), suvim rezancima šećerne repe (SRŠR), parenhimskom tkivu stabla kukuruza (PTSK) u obliku diska, na kombinovanim nosačima od PTSK u obliku diska obloženog Ca-alginatom(K1) i ispunjenog Ca-aglinatom (K2), na kuglicama Caalginata(AB) kao i na kombinovanim kuglicama od Caalginata i mliva PTSK (ABC). Imobilisane ćelije kvasca su primenjene za fermentaciju melase i gustog soka šećerne repe sa krajnjim ciljem da se racionalnim korišćenjem među- i nusproizoda procesa prerade šećerne repe postigne efikasna proizvodnja etanola uz smanjene troškove proizvodnje kao, i uz smanjenje emisije otpadnih tokova. U radu je ustanovljeno da su PRŠR, SRŠR i PTSK efikasni nosači za imobilizaciju ćelija kvasca zahvaljujući prisustvu pozitivno naelektrisanih funkcionalnih grupa, visokoj poroznosti, hidrofilnosti, mehaničkoj čvrstini i stabilnosti. Takođe ovi nosači štite kvasac od osmotskog stresa, toksičnog dejstva etanola i inhibitora. Zahvaljujući heterogenoj strukturi PRŠR, SRŠR i PTSK se mogu koristiti kao efikasni adsorbenti za ćelije kvasca, kao i za uklanjanje katjonskih i anjonskih komponenata u postupku prerade otpadnih voda. Pored toga, utvđeno je da PTSK predstavlja alternativni obnovljivi izvor hranljivih materija neophodnih kvascu tokom fermentacije melase i gustog soka, a takođe deluje i kao antipenušavac. Primenom ćelija kvasca imobilisanih na SRŠR ostvarena je maksimalna produktivnost etanola od 1,48 g/lh za melasu i 1,57 g/lh za gusti sok, pri početnoj koncentraciji šećera u podlozi 180 g/l. Primenom ćelija kvasca imobilisanih na PTSK u obliku diska (visine oko 5 mm i prečnika oko 20 mm) postignuta je produktivnost etanola 1,26 g/lh za melasu 1,42 g/lh za gusti sok, pri početnoj koncentraciji šećera 150 g/l. Osnovni nedostatak primene imobilisanih ćelija na SRŠR i PTSK u alkoholnoj fermentaciji je lako ispiranje ćelija sa nosača. Kombinovani nosači u obliku diska PTSK obloženog Ca alginatom (K1) i ispunjenog Ca-aglinatom (K2) su pripremljeni kako bi se sprečilo ispiranje ćelija kvasca. Utvrđeno je da nosač K1 nije adekvatan za povećanje efikasnosti imobilizacije. Imobilizacijom kvasca punjenjem nosača K2 je povećana efikasnost imobilizacije ćelija kvasca na PTSK, ali je usled velike zapremine i kompaktnosti nosača K2 tokom fermentacije delimično otežan transport supstrata i produkata kroz disk. Melasa i gusti sok šećerne repe su veoma dobre sirovine za proizvodnju etanola, usled visokog sadržaja fermentabilnih šećera, koji slobodne i/ili imobiliane ćelije S. cerevisiae mogu direktno koristiti za fermentaciju. Međutim, uzimajući u obzir hemijski sastav ovih sirovina i ostvarene parametre fermentacije, utvrđeno je da je gusti sok bolja sirovina za proizvodnju etanola od melase, posebno u VHG uslovima. Takođe je utvrđeno da se gusti sok može koristiti kao sirovina za fermentaciju bez dodataka hranljivih materija. Ustanovljeno je da su melase koje preostaju nakon osmotske dehidratacije crvenog kupusa i mrkve veoma dobre sirovine za proizvodnju etanola pri početnoj koncentraciji šećera u podlozi do 150 g/l, ali nisu pogodne sirovine za VHG fermentaciju pomoću slobodnih i imobilisanih ćelija u AB kuglicama. Fermentacijom melase nakon osmotske dehidratacije kupusa i mrkve početne koncentracije šećera 125 g/l, primenom ćelija kvasca imobilisanih u AB kuglicama, ostvarena je najviša produktivnost etanola od 1,24 g/lh i 1,30 g/lh. Tokom fermentacije melase i gustog soka primenom ćelija kvasca imobilisanih u AB kuglicama usled izdvajanja CO2, dolazi do narušavanja strukture kuglica pojavom poprečne pukotine koja kuglicu polimera deli na dva približno jednaka dela. Kako bi se sprečila degradacija Ca-alginata tokom fermentacije pripremljen je novi kombinovani nosač od Caalginata i mliva PTSK (ABC). Dodatkom samlevenog PTSK sa mikrostrukturom pčeljinjeg saća u Ca-alginat je povećana poroznost kuglica čime je omogućen efikasniji prenos mase supstrata i produkata, povećana je raspoloživa površina za adsorpciju i rast ćelija kvasca kao i čvrstina i stabilost kuglica. Poređenjem parametara fermentacije, utvrđeno je da su ćelije kvasca imobilisane na ABC kuglicama efikasniji biokatalizator u poređenju sa slobodnim ćelijama kvasca, kao i u poređenju sa ćelijama imobilisanim u AB kuglicama. Dodatkom samlevenog PTSK u podlogu ili u Ca-alginat povećava se sadržaj etanola i metanola, smanjuje se sadržaj kiselina i acetaldehida u sirovom destilatu, dok se sadržaj viših alkohola, estara i furfurala ne menja značajno. Ćelije kvasca imobilisane u kombinovanim ABC kuglicama se mogu uspešno primeniti za pet ponovljenih fermentacija gustog soka pri standardnim (NG) i uslovima visoke koncentracije šećera (VHG) pri čemu se može postići produktivnost etanola 1,92-2,30 g/lh. Primenom imobilisanih ćelija kvasca u kombinovanim ABC kuglicama u kontinualnoj VHG fermentaciji gustog soka, početne koncentracije šećera 300 g/l, ostvaren je stabilan fermentacioni sistem tokom 15 dana, pri čemu je produktivnost etanola iznosila 3,29 do 4,66 g/lh.

Bioethanol production from intermediate and byproducts of sugar beet processing has a beneficial scope in view of the socio-economic development and regional economy in countries with developed sugar industry, such as Serbia. Saccharomyces cerevisiae strain is the most widely used ethanol producing microorganism. To increase the efficiency of ethanol production, many process improvements including immobilized cells application and fermentation of very high gravity (VHG) media with initial sugar over 250 g/l, have been studied. In the present work yeast S. cerevisiae was immobilized onto different new carriers: pressed sugar beet pulp (PSBP), dried sugar beet pulp (DSBP), maize stem ground tissue (MSGT) disks, MSGT discs coated with Ca-alginate (K1) and MSGT discs filled with Ca-alginate (K2), Ca-alginate beads (AB) and combined beads made of Ca-alginate and maize stem ground tissue meal (ABC). Immobilized yeast cells were used for ethanol fermentation of molasses and thick juice with purposes to obtain efficient ethanol production, to lower high operating costs and to achieve the zero-waste goal through a rational use of by-products of sugar beet processing. In the present work it was found that PSBP, DSBP and MSGT are efficient carriers for yeast cell immobilization due to the presence of positively charged binding sites, high porosity and hidrophylicity, good mechanical strength and stability, while functioned as a fortification against osmotic stress, toxins and inhibitors. It was also found that due to the heterogeneous structure the PSBP, DSBP and MSGT are promising adsorbents for the removal of cationic and anionic compounds from aqueous solutions in the waste water treatment. Besides, it is found that the MSGT can be used as an alternative nutrient source for yeast cells and as an anti foaming agent. A maximum ethanol productivity of 1.48 g/lh and 1.57 g/lh was achieved in the fermentation of molasses and thick juice (initial sugar of 180 g/l) using yeast immobilized on DSBP. The highest values of ethanol productivity, obtained in the case of using yeast immobilized on MSGT discs as biocatalyst, for molasses and thick juice (initial sugar of 150 g/l) fermentation were 1.26 g/lh and 1.42 g/lh. The main disadvantage of using DSBP and MSGT supported biocatalyst is intensive leakage of yeast cells during the fermentation. In order to prevent yeast leakage combined carriers in the form of MSGT discs coated with Ca-alginate (K1) and MSGT discs filled with Ca-alginate (K2) were prepared. The K1 carrier was found to be unsuccessful for improving yeast immobilization efficiency, while the application K2 carrier improved yeast immobilization efficiency during the fermentation. However, due to the large volume and compactness of the K2 carrier substrate and product mass transfer limitation were observed during the fermentation. The sugar beet molasses and thick juice are very good raw materials for ethanol production due to high content of fermentable sugars, which can be directly used for fermentation by free and/or immobilized S. cerevisiae cells without any modification. However, taking into consideration quality of these raw materials and obtained fermentation parameters, sugar beet thick juice was found to be more suitable raw material for ethanol fermentation, compared to molasses, particularly in the VHG fermentation process and can be used without any nutrient supplementation. Similarly, it was found that molasses left after the osmotic dehydratation of red cabbage (M1) and carrots (M2) are excellent raw materials for ethanol fermentation of media with initial sugar concentration up to 150 g/l, while they are not convenient for VHG fermentation by free or immobilized yeast cells in AB carrier. Maximum ethanol productivity obtained at the end of fermentation of molasses M1 and M2 by immobilized yeast in AB carrier was 1.24 g/lh and 1.30 g/lh, respectively. The release of CO2 during the fermentation of molasses and thick juice by yeast cells immobilized in the AB, lead to breakage of polymer beads on two halves. In order to prevent AB disruption, a new combined yeast carrier (ABC) was developed by the addition of MSGT meal into the Ca-alginate. It was found that the addition of MSGT meal, with honeycomb microstructure, provided large surface area for yeast cell attachment and biofilm growth, and also increased alginate matrix porosity, enabling better mass transfer characteristic, better physical strength and stability of beads. The highest values of fermentation parameters were obtained in the fermentation system with yeast immobilized on ABC carrier in comparison with free yeast cells and yeast immobilized on AB carrier. The Ca-alginate and medium supplementation with MSGT meal significantly increased ethanol and methanol content, decreased acetaldehyde and acetic acid content of the distillate, but did not affect fusel alcohol, ester and furfural content of the distillate. Repeated batch normal gravity (NG) and very high gravity (VHG) ethanol fermentation of thick juice by yeast immobilized on ABC carrier was successfully carried out for at least five successive cycles without any significant decrease in ethanol productivity which was in the range 1.92-2.30 g/lh. Continuous VHG ethanol fermentation of thick juice (initial sugar of 300 g/l) using yeast immobilized on ABC was stable for at least 15 days while achieved ethanol productivity was 3.29-4.66 g/lh.