Modifikacija -SH grupe proteina α- dikarbonilnim jedinjenjima : identifikacija proizvoda, mogućnosti određivanja i primene u kliničkoj praksi
Modification of protein - SH group with α-dicarbonyl compounds: identification of products, the possibilities of determination and application in clinical practice
Докторанд
Aćimović, Jelena M.Ментор
Mandić, Ljuba M.Чланови комисије
Mandić, Ljuba M.Vrvić, Miroslav
Spasić, Mihajlo B.
Метаподаци
Приказ свих података о дисертацијиСажетак
α-Dikarbonilna jedinjenja su veoma reaktivna, reaguju sa nukleofilnim grupama
bocnih ostataka Lys i Arg, N-terminalnom amino-grupom i tiol-grupom ostatka Cys na
površini molekula proteina i tako ih modifikuju. U disertaciji je ispitan doprinos tiolgrupe
modifikaciji proteina metilglioksalom (MG), kinetika i konkurentnost ove
reakcije u odnosu na reakcije amino- i guanidino-grupe. Nađeno je da i pored male
zastupljenosti tiol-grupe na površni molekula proteina (kod HSA oko 80 puta manja u
odnosu na ukupan broj amino- i guanidino-grupa) ona reaguje u velikom procentu (do
65 %), ucestvuje u umrežavanju molekula proteina (stvaranju dimera i oligomera) preko
nagrađenih HSA-MG (HSA-amino-MG ili HSA-SH-MG) intermedijera sa udelom od
4% u slucaju nedovoljne kolicine metilglioksala Povecanje koncentracije metilglioksala
utice na brzinu reakcije sa tiol-grupom, na vreme uspostavljanja ravnoteže, na doprinos
tiol-grupe modifikaciji molekula proteina, ali ne utiče na procenat izreagovanih grupa u
...stanju ravnoteže (60 %), što omogucava ekstrapolaciju dobijenih rezultata na niže,
fiziološke koncentracije metilglioksala.
U okviru teze su razvijene spektrofotometrijske metode zasnovane na reakciji
amino-grupa sa p-benzohinonom i guanidino-grupa sa reagensom koji sadrži timol i
natrijum-hipobromit. Metode su precizne (RSD u opsegu 1.2-1.8 %, odnosno 0.9–2.0
%, resp.) i tačne (100.6 ± 1.2 %, 99.8 ± 0.8 %, redom), što ih cini pogodnim za
kvantifikaciju ovih grupa za vreme karbonilovanja in vitro.
Uticaj mikrookoline tiol-grupe na njenu reakciju sa metilglioksalom ispitan je sa
aminokiselinama (Cys, NAcCys i CMC), peptidom (GSH) i proteinom (HSA).
Utvrđeno je da mikrookolina –SH grupe utice na njenu reaktivnost i na prinos proizvoda
reakcije. Reaktivnost tiol-grupe opada u nizu Cys>GSH>NAcCys, za sve ispitivane
odnose koncentracija reaktanata. CMC ne reaguje sa metilglioksalom. Prisustvo α-
amino-β-merkapto-etanske grupe u tiol-jedinjenju povecava reaktivnost tiol-grupe.
Predožen je reakcioni put za reakciju Cys i metilglioksala po kome slobodna α-
amino-grupa molekula Cys (cija je tiol-grupa u reakciji sa metilglioksalom vec
nagradila hemitioacetal), reaguje sa slobodnom acetil-karbonilnom grupom
hemitioacetala. Stvara se tiazolidinski intermedijer, koji dalje prelazi u stabilniji proizvod Cys-MG-glikozilamin...
α-Dicarbonyles are reactive compounds that react with the nucleophilic groups
of Lys and Arg side chains, thiol group of Cys and N-terminal amino on the protein
surface, modifying them. In this thesis, the contribution of thiol group to protein
modification with methylglyoxal (MG), kinetics and competitivness of this reaction
with those of amino and guanidino groups reactions were inestigated. Although less
abundant, thiol groups present on the protein surface (approx. 80 times lower then total
number of amino and guanidino groups in HSA), are found to be reactive in
considerable percentage (up to 65 %) and are participated in protein cross-linking
(dimer and oligomer production), through HSA-MG intermediates (HSA-amino-MG or
HSA-SH-MG), with 4% in case of unsufficient amount of MG. Increase in
methylglyoxal concentration influences the reaction rate with thiol group, the time for
the reaction to reach equilibrium and the contribution of thiol group to modification of
proteins, yet it ...has no influence on the percent of reacted groups (60 %) when chemical
equilibrium is reached, enabling extrapolation of the obtained results to lower,
physiological concentrations of methylglyoxal.
Spectrophotometric methods, based on the reaction of amino groups with pbenzoquinone
and guanidino groups with thimol and sodium hypobromite reagent, have
been developed. The methods are precise (RSD 1.2-1.8 % and 0.9–2.0 %, respectively)
and accurate (100.6±1.2 %; 99.8±0.8 %, resp.), and therefore suitable for quantification
of these groups during carbonylation process in vitro.
The influence of microenviroment of thiol group on its reactivity with MG has
been examined using amino acids (Cys, NAcCys and CMC), peptide (GSH) and protein
(HSA). It has been shown that microenviroment of thiol group influences its reactivity
and the product yield. The reactivity of thiol group decreases in the order
Cys>GSH>NAcCys, for all concentration ratios examined. CMC doesn’t react with
MG. The presence of α-amino-β-mercapto ethane group in thiol compound increases the
reactivity of thiol group.
The reaction pathway for Cys and MG reaction was proposed, in which the free
α-amino group of Cys (whose thiol group is already in the form of hemithioacetale with MG) reacts with the free acetil carbonyl group of hemithioacetale...
Факултет:
Универзитет у Београду, Хемијски факултетДатум одбране:
2012Пројекти:
- Алергени, антитела, ензими и мали физиолошки значајни молекули: дизајн, структура, функција и значај (RS-172049)