Proteinski inženjering i razvoj visoko efikasnih metoda za pretraživanje biblioteke gena celobioza-dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium za povećanje enzimske aktivnosti

Abstract

Celobioza-dehidrogenaza (CDH) je ekstracelularni enzim proizveden od strane mnogih gljiva bele truleži, uključujući i dobro proučen P. chrysosporium. Enzim oksiduje širok spektar elektron akceptora kao što su krajevi celobioze i celo-oligosaharida, produkata celulozne biorazgradnje, do njihovih odgovarajućih 1,5-laktona, koji se potom spontano hidrolizuju do karboksilnih kiselina u vodenim rastvorima. Smatra se da zajedno sa celulazama i lignin peroksidazama CDH igra važnu ulogu u biološkoj razgradnji nerastvorne celuloze od strane gljiva bele truleži. CDH takođe može da osim na solubilne elektron akceptore prenese elektrone i na elektrodu i da se iskoristi za pravljenje amperometrijskih biosenzora za merenje koncentracije celobioze i naročito detekciju laktoze u hrani. Da bi se poboljšala upotrebljivost CDH za razgradnju celuloze, proizvodnju celobionske i laktobionske kiseline kao i za merenje koncentracije disaharida neophodno je povećati njenu aktivnost i eventualno stabilnost. Da bi to postigli mi smo koristili metode proteinskog inženjeringa i visoko efikasne pretrage biokatalizatora. Proteinski inženjering podrazumeva promenu nukleotidne sekvence gena koji kodira određeni protein u cilju promene njegove aktivnosti i stabilnosti. Kloniranje gena celobioza-dehidrogenaze iz P. chrysosporium u Saccharomyces cerevisiae InvSC1 je omogućilo korišćenje dirigovane evolucije na našem sistemu. Nasumičnom mutagenezom su dobijeni i nađeni mutanti sa povišenom aktivnošću. Strukturne analize su pokazale da mutacije utiču na aktivnost bilo da se nalaze u blizini aktivnog mesta, bilo preko udaljenih interakcija. Najbolji mutant je pokazao 2,2 puta povećanu kcat za laktozu i celobiozu kao supstrate...

Celobioza dehydrogenase (CDH) is an extracellular enzyme produced by many white-rot fungi, including a well-studied Phanerochaete chrysosporium. The enzyme oxidizes a wide range of electron acceptors such as reducing ends of celobiose, cello-oligosaccharides, and cellulose biodegradation products, to their corresponding 1,5-lactones, which are then in an aqueous solutions spontaneously hydrolysed to carboxylic acids. It is believed that together with cellulases and lignin peroxidases, CDH plays an important role in biodegradation of insoluble cellulose by the white-rot mushroom. CDH can transfer electrons to the soluble electron acceptors and also directly to the electrodes and therefore can be used in amperometric biosensors for measuring concentrations of cellobiose and for detection of lactose in food. In order to improve the usability of CDH for cellulose degradation, production of celobionic and lactobionic acid, as well as measurement of the concentration of disaccharides, it is necessary to increase CDH activity and eventually stability. To achieve this, we used methods of protein engineering and high throughput screening of biocatalysts. Protein engineering implies the change in a nucleotide sequence of the gene encoding the protein in order to change its activity and stability. Cloning of cellobiose-dehydrogenase gene from P. chrysosporium into Saccharomyces cerevisiae InvSC1 has enabled the use of a directed evolution on our system. Mutants with increased activity were obtained by random mutagenesis and screening. Structural analyzes showed that mutations can affect the activity whether they are close to the active site or from distant interactions. The best mutant showed a 2.2-fold increase in kcat for lactose and cellobiose as substrates...