Funkcionalna karakterizacija gena DSS1(I) i DSS1(V) u odgovoru Arabidopsis thaliana na oksidativni stres

Abstract

DSS1 je mali, visoko konzervisan protein i pripada familiji prirodno neuređenih proteina. Novija istraživanja su otkrila ulogu DSS1 u procesu DSSilacije, koja podrazumeva specifično označavanje oksidovanih proteina za uklanjanje putem proteazomnog sistema. Genom Arabidopsis thaliana sadrži dva visoko homologna gena DSS1(I) i DSS1(V). Najbolje proučena uloga DSS1 u biljnom svetu je u održavanju integriteta DNK kroz homolognu rekombinaciju (HR). Cilj ovog rada je bio da se identifikuju funkcionalne različitosti između proteina DSS1 sa fokusom na njihovu potencijalnu ulogu u oksidativnom stresu. Istraživanje je zasnovano na ispitivanju različitih dss1 mutantnih linija u model sistemu A. thaliana, kroz uporednu analizu sa biljkama divljeg tipa, u normalnim fiziološkim uslovima i uslovima oksidativnog stresa. Pokazano je da t-dss1(V) T-DNK insercioni mutanati imaju brže klijanje, dok u kasnijim fazama zaostaju u razviću. Dodatno, uspostavljene su pojedinačne linije mutanata dss1(I).19 i dss1(V).20 sa velikim indelima pomoću precizne tehnologije CRISPR/Cas9. Kod ovih mutanata su uočene razlike u dužini korena, stabla i površini rozete. Utvrđeno je da su mutanati t-dss1(V) (knockdown) i dss1(V).20 (knockout) visoko osetljivi na oksidativni stres. Takođe, nemogućnost generisanja dss1 duplih mutanata ukazuje na njihovu esencijalnu ulogu u biološkim procesima. Pored toga, pokazano je da samo overekspresija AtDSS1(I) kroz test funkcionalne komplementacije dovodi do povećanja rezistencije Δdss1 mutanta Ustilago maydis na ispitivane genotoksične agense, što ukazuje na evolutivnu očuvanost njegove uloge u popravci DNK putem HR. U skladu sa navedenim, postoji funkcionalna razlika između biljnih gena DSS1 i može se smatrati da je protein DSS1(V) ključna komponenta u biljnom odgovoru na oksidativni stres.

DSS1 is a small, highly conserved protein and a member of the intrinsically disordered protein family. Recent studies revealed the role of DSS1 in a process called DSSylation, which represents the specific marking of oxidatively damaged proteins for removal by the proteasome system. The Arabidopsis genome contains two highly homologous genes DSS1(I) and DSS1(V) and role in maintaining DNA integrity through homologous recombination is the only well-studied function in plants. The aim of this work was to identify functional differences between DSS1 proteins by focusing on their potential roles in oxidative stress and considering that plants are sessile organisms exposed to harmful environmental influences. This study is based on examining various dss1 mutant lines in the model system A. thaliana through comparative analysis with wild-type plants, under normal physiological conditions and oxidative stress. It was shown that t-dss1(V) T-DNA insertion mutants have faster germination, while having developmental delay in further stages. Additionally, single dss1(I).19 and dss1(V).20 mutant lines with large indels were generated using precision CRISPR/Cas9 technology. The characterization of these mutant lines revealed differences in root and stem lengths, and rosette area size. t-dss1(V) (knockdown) and dss1(V).20 (knockout) mutants showed an increased sensitivity to oxidative stress. In this work, the dss1 double mutant was not obtained. Also, only overexpressing AtDSS1(I) through functional complementation test increases resistance of the Δdss1 mutant of U. maydis to the exposed genotoxic agents. This indicates its conserved role in DNA repair via HR. Our study showed functional differences between plants DSS1 genes and a potentially important component DSS1(V) in plant oxidative stress response.