Filamentous bacteriophages of species Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Filamentous bacteriophages are widely distributed in the bacterium Pseudomonas aeruginosa and their infection leads to significant changes in the henotype of this bacterial species. This group of phages is designated Pf and belongs to the Inoviridae family. The first step in analyzing this group of phages was to obtain a suspension with a high virus titer. Given that there is no described method for multiplying integrative filamentous phages, two methods for their multiplication were designed, described and compared using the example of Pf filamentous. For this purpose, three reference strains of P. aeruginosa LESB58, PAO1 and UCBPP-PA14 (PA14), which are naturally infected with filamentous phages PfLES58, Pf4 and Pf5, were used. Method 1 involved propagation of phages in 6 L of bacterial culture for 48 hours, while method 2 used 600 mL of culture and incubation lasted six days with the addition of fresh medium and inoculum every two days. The phage suspension from method 1 was purified from bacteria by centrifugation and then by filtration (0.45 and 0.22 μm), while the phage suspension from method 2 was purified only by centrifugation on several occasions, that is, until the bacterial sediment was no longer visible. In both cases, the purified phages were then ultracentrifuged and dialyzed. Method 2 proved to be far superior to method 1 according to all tested parameters. The significance of method 2 is that it can also be used for the multiplication of filamentous phages of other bacterial species. Isolation of viral DNA from multiplied Pf phages and treatment with different enzymes indicated the presence of single-stranded DNA in PfLES58, Pf4 and Pf5 phages. Also, in all three phages, the presence of the main capsid protein (CoaB) was determined by SDS PAGE analysis. The CoaB protein is characteristic of filamentous phages from the Inoviridae family. Of all tested bacteriophages, PfLES58 (90.6%) had the widest lytic spectrum, followed by Pf5 (62.5%), while Pf4 (46.1%) had the narrowest. Subinhibitory concentrations of ciprofloxacin and mitomycin C can increase the production of PfLES58, Pf4 and Pf5 bacteriophages. A similar effect in production was also recorded in mutants that appear after infection with an obligatory lytic phage. It was successfully established that the released Pf phage virions can infect other P. aeruginosa strains and affect changes in their phenotype. Differences between Pf infected and uninfected strains were apparent. In infected strains, a decrease in cell autoaggregation and pyoverdine and pyocyanin production was recorded. On the other hand, motility by flagella and biofilm production were significantly increased in infected strains. In addition, the occurrence of small colony variants has increased in some strains. Such effects lead to the appearance of strains that are more prone to establishing chronic infections. Pf bacteriophages increased the sensitivity of infected strains to certain antibiotics, such as tetracycline, ceftazidime and streptomycin, opening a new field in phage therapy where filamentous phages would be used in the fight against bacterial infections.

Филаментозни бактериофаги су широко распрострањени у бактерији Pseudomonas aeruginosa и њиховом инфекцијом долази до значајних промена у фенотипу ове бактеријске врсте. Ова група фага је означена као Pf и припадају фамилији Inoviridae. Први корак у испитивању ове групе фага је био добијање суспензије са високим титром вируса. С обзиром на то да не постоји описана метода за умножавање интегративних филаментозних фага, на примеру Pf филаментозних фага дизајниране су, описане и упоређене две методе за њихово умножавање. У ту сврху, искоришћена су три референтна соја бактерије P. aeruginosa LESB58, PAO1 i UCBPP-PA14 (PA14), која су природно инфицирана са филаментозним фагима PfLES58, Pf4 и Pf5. Метода 1 је подразумевала умножавања фага у 6 L бактеријске културе 48 сати, док је методом 2 искоришћено 600 mL културе и инкубација је трајала шест дана са додавањем свежег медијума и инокулума на свака два дана. Суспензија фага из метода 1 је пречишћена од бактерија центрифугирањем па потом филтрацијом (0,45 и 0,22 μm) док је суспензија фага из методе 2 пречишћена искључиво центрифугирањем у више наврата, односно док талог бактерије није више био видљив. У оба случаја, пречишћени фаги су потом ултрацентрифугирани и дијализирани. Метода 2 се по свим провереним параметрима показала као далеко супериорнија у односу на методу 1. Значај методе 2 је и у томе што се може примењивати и за умножавање филаментозних фага других бактеријских врста. Изолација виралне ДНК из умножених Pf фага и третман различитим ензимима указао је на присуство једноланчане ДНК код PfLES58, Pf4 i Pf5 фага. Такође, код сва три фага утврђено је присуство главног протеина капсида (CoaB) SDS анализом. CoaB протеин је карактеристичан за филаментозне фаге из фамилије Inoviridae. Од свих испитаних бактериофага, најшири литички спектар има PfLES58 (90.6%), а потом Pf5 (62.5%), док је најужи имао Pf4 (46.1%). Субинхибиторне концентрације ципрофлоксацина и митомицина Ц могу да повећавају продукцију PfLES58, Pf4 и Pf5 бактериофага. Сличан ефекат у продукцији је забележен и код мутаната који се јављају након инфекције облигатно литичким фагом. Успешно је утврђено да ослобођени вириони Pf фага могу инфицирати друге P. aeruginosa сојеве и утицати на промене у њиховом фенотипу. Разлике између Pf инфицираних и неинфицираних сојева су биле очигледне. Код инфицираних сојеве је забележено смањење у аутоагрегацији ћелија и у производњи пиовердина и пиоцијанина. С друге стране, значајно је повећана покретљивост флагелама и производња биофилма код инифицираних сојева. Осим тога, код неких сојева је повећана појава варијанти малих колонија (енг. small colony variants). Овакви ефекти доводе до појаве сојева који су склонији успостављају хроничних инфекција. Pf бактериофаги су повећавали осетљивост инфицираних сојева на одређене антибиотике, као што су тетрациклин, цефтазидим и стрептомицин, отварајући ново поље у терапији фагима где би се филаментозни фаги користили у борби против бактеријских инфекција.

Filamentozni bakteriofagi su široko rasprostranjeni u bakteriji Pseudomonas aeruginosa i njihovom infekcijom dolazi do značajnih promena u fenotipu ove bakterijske vrste. Ova grupa faga je označena kao Pf i pripadaju familiji Inoviridae. Prvi korak u ispitivanju ove grupe faga je bio dobijanje suspenzije sa visokim titrom virusa. S obzirom na to da ne postoji opisana metoda za umnožavanje integrativnih filamentoznih faga, na primeru Pf filamentoznih faga dizajnirane su, opisane i upoređene dve metode za njihovo umnožavanje. U tu svrhu, iskorišćena su tri referentna soja bakterije P. aeruginosa LESB58, PAO1 i UCBPP-PA14 (PA14), koja su prirodno inficirana sa filamentoznim fagima PfLES58, Pf4 i Pf5. Metoda 1 je podrazumevala umnožavanja faga u 6 L bakterijske kulture 48 sati, dok je metodom 2 iskorišćeno 600 mL kulture i inkubacija je trajala šest dana sa dodavanjem svežeg medijuma i inokuluma na svaka dva dana. Suspenzija faga iz metoda 1 je prečišćena od bakterija centrifugiranjem pa potom filtracijom (0,45 i 0,22 μm) dok je suspenzija faga iz metode 2 prečišćena isključivo centrifugiranjem u više navrata, odnosno dok talog bakterije nije više bio vidljiv. U oba slučaja, prečišćeni fagi su potom ultracentrifugirani i dijalizirani. Metoda 2 se po svim proverenim parametrima pokazala kao daleko superiornija u odnosu na metodu 1. Značaj metode 2 je i u tome što se može primenjivati i za umnožavanje filamentoznih faga drugih bakterijskih vrsta. Izolacija viralne DNK iz umnoženih Pf faga i tretman različitim enzimima ukazao je na prisustvo jednolančane DNK kod PfLES58, Pf4 i Pf5 faga. Takođe, kod sva tri faga utvrđeno je prisustvo glavnog proteina kapsida (CoaB) SDS analizom. CoaB protein je karakterističan za filamentozne fage iz familije Inoviridae. Od svih ispitanih bakteriofaga, najširi litički spektar ima PfLES58 (90.6%), a potom Pf5 (62.5%), dok je najuži imao Pf4 (46.1%). Subinhibitorne koncentracije ciprofloksacina i mitomicina C mogu da povećavaju produkciju PfLES58, Pf4 i Pf5 bakteriofaga. Sličan efekat u produkciji je zabeležen i kod mutanata koji se javljaju nakon infekcije obligatno litičkim fagom. Uspešno je utvrđeno da oslobođeni virioni Pf faga mogu inficirati druge P. aeruginosa sojeve i uticati na promene u njihovom fenotipu. Razlike između Pf inficiranih i neinficiranih sojeva su bile očigledne. Kod inficiranih sojeve je zabeleženo smanjenje u autoagregaciji ćelija i u proizvodnji pioverdina i piocijanina. S druge strane, značajno je povećana pokretljivost flagelama i proizvodnja biofilma kod inificiranih sojeva. Osim toga, kod nekih sojeva je povećana pojava varijanti malih kolonija (eng. small colony variants). Ovakvi efekti dovode do pojave sojeva koji su skloniji uspostavljaju hroničnih infekcija. Pf bakteriofagi su povećavali osetljivost inficiranih sojeva na određene antibiotike, kao što su tetraciklin, ceftazidim i streptomicin, otvarajući novo polje u terapiji fagima gde bi se filamentozni fagi koristili u borbi protiv bakterijskih infekcija.