Molekularni mehanizmi protektivnog dejstva grafenskih kvantnih tačaka u in vitro modelu oštećenja neuronskih ćelija oksidativnim stresom
Molecular mechanisms of graphene quantum dots induced cell protection in the in vitro model of oxidative stress-mediated neuronal cell damage
Докторанд
Krunić, MatijaМентор
Trajković, VladimirЧланови комисије
Ristić, BiljanaMisirlić Denčić, Sonja
Paunović, Verica
Bošnjak, Mihajlo
Метаподаци
Приказ свих података о дисертацијиСажетак
U ovoj doktorskoj disertaciji ispitivani su molekularni mehanizmi protektivnog dejstva
grafenskih kvantnih tačaka (GKT) u oksidativnom stresu indukovanom natrijum nitroprusidom
(engl. sodium nitroprusside, SNP) u ćelijama humanog neuroblastoma. Povećane koncentracije
reaktivnih kiseoničnih (RKV) i azotnih vrsta (RAV) unutar ćelija indukuju oksidaciju i nitraciju
proteina, peroksidaciju lipida i oštećuju molekul DNK, što dovodi do apoptoze ili nekroze ćelija.
Nervne ćelije su posebno osetljive na oštećenja uzrokovana oksidativnim stresom usled značajne
potrošnje molekulskog kiseonika, visokih koncentracija višestruko nezasićenih masnih kiselina
podložnih procesu lipidne peroksidacije i slabih antioksidativnih mehanizama. Visoki nivoi
RKV i RAV dovode do oštećenja i smrti neuronskih i glijalnih ćelija, koja je u osnovi
patogeneze Parkinsonove bolesti, Alchajmerove bolesti, multiple skleroze i ishemijske bolesti
mozga. Usled ograničenja postojeće antioksidativne terapije, noviji pristupi ...bazirani su na
antioksidativnim svojstvima sintetičkih materijala, od kojih se ističu GKT. GKT su ovalne
ugljenične dvodimenzionalne nanočestice, koje se karakterišu izrazitom biokompatibilnošću,
niskom citotoksičnošću i izraženim antioksidativnim karakteristikama. Uz to, GKT indukuju
proces autofagije, koji predstavlja mehanizam razgradnje oštećenih ćelijskih organela i proteina
u autolizozomima nastalim spajanjem lizozoma i autofagozoma. Neuroni su veoma osetljivi na
poremećaje proteolitičke razgradnje ćelijskog materijala u procesu autofagije, a povećano
nakupljanje oštećenih proteina predstavlja osnovu patogeneze brojnih neurodegenerativnih
oboljenja. U ovoj doktorskoj disertaciji ispitani su molekularni mehanizmi koji se nalaze u
osnovi antioksidativnih i proautofagnih karakteristika GKT.
Rezultati istraživanja pokazali su da GKT smanjuju citotoksičnost indukovanu SNP,
utičući na smanjenje mitohondrijalne depolarizacije, aktivnosti kaspaze-2 i apoptotske smrti SH-
SY5Y ćelija humanog neuroblastoma. Iako je tretman GKT smanjivao nivo azot (II) oksida
(NO) nakon tretmana SNP, tretman supstancama koje vezuju NO nisu imale značajan uticaj na
uočenu protekciju SH-SY5Y ćelija. Pokazano je da neutralizacija NO nije ključan mehanizam u
GKT indukovanoj zaštiti ćelija od citotoksičnosti SNP. Tretman GKT smanjivao je nivoe
hidroksilnog radikala (OH•), superoksidnog radikala (O2•−) i lipidne peroksidacije indukovane
SNP. Tretmani neselektivnim antioksidantima, kao i supstancama sa sposobnošću vezivanja OH•
i jona gvožđa (Fe2+), ukazali su da GKT štite ćelije neutrališući OH• nastao u reakciji Fe2+ jona
oslobođenih iz SNP i vodonik peroksida (H2O2). Unutarćelijska lokalizacija GKT neophodna je
za zaštitu ćelija od oksidativnog stresa indukovanog SNP. Kombinovani tretman GKT i SNP
takođe je indukovao autofagiju inhibicijom Akt/PRAS40/mTOR signalnog puta. Indukcija
autofagije pokazana je na transkripcionom i post-translacionom nivou. Antioksidativne i
proautofagne karakteristike GKT nisu međusobno uslovljene, s obzirom da tretman
antioksidansima (N-acetilcistein i DMSO) nije indukovao autofagiju u kombinovanom tretmanu
sa SNP. Tretman farmakološkim inhibitorima rane (vortmanin i 3-metiladenin) i kasne faze
autofagije (amonijum hlorid) smanjio je protektivno dejstvo GKT, što potvrđuje ulogu autofagije
u ovom procesu.
Dobijeni rezultati ukazuju da GKT štite SH-SY5Y ćelije od neurotoksičnosti indukovane
SNP delujući dvostruko, kao antioksidansi i aktivatori citoprotektivne autofagije. Ispitivanje
efekata GKT u ovom modelu citotoksičnosti moglo bi da doprinese razjašnjavanju molekularnih
mehanizama koji se nalaze u osnovi njihovog neuroprotektivnog dejstva. Od naročitog značaja u
ovom kontekstu je uticaj modulacije oksidativnog stresa i autofagije, kao bitnih regulatora
neurotoksičnosti sa potencijalnom ulogom u terapiji neurodegenerativnih i neuroinflamatornih
oboljenja.
This dissertation examined the molecular mechanisms of graphene quantum dot (GQD)-
mediated protection of the human neuroblastoma cells from oxidative stress induced by sodium
nitroprusside (SNP). Increased intracellular levels of reactive oxygen (ROS) and nitrogen species
(RNS) are involved in protein oxidation and nitration, lipid peroxidation and DNA damage,
which ultimately lead to apoptotic or necrotic cell death. Neurons are particularly sensitive to the
damage caused by oxidative stress due to significant consumption of molecular oxygen, high
concentrations of unsaturated fatty acids susceptible to lipid peroxidation, and weak antioxidant
mechanisms. High levels of ROS and RNS are involed in the damage and death of neurons and
glia in Parkinson's disease, Alzheimer's disease, multiple sclerosis, and ischemic brain damage.
Due to the limitations of existing antioxidant therapy, newer approaches are based on the
antioxidant properties of synthetic materials, out of which GQD have ...shown the most promise.
GQD are oval, two-dimensional carbon nanoparticles, characterized by their distinctive
biocompatibility, low cytotoxicity and exceptional antioxidant properties. In addition to
antioxidant characteristics, GQD can induce autophagy, a cellular mechanism used for
degradation of the damaged cell compartments and proteins in autolysosomes, formed by the
fusion of lysosomes and autophagosomes. Neurons are particularly sensitive to disturbances in
proteolitic cellular material degradation in the autophagy process, and the increased
accumulation of damaged proteins is the main cause of numerous neurodegenerative diseases.
This research examined the molecular mechanisms of the antioxidative and proautophagic
actions of GQD.
The results of this study showed that GQD reduce SNP cytotoxicity through the decrease of
mitochondrial depolarization, caspase-2 activity, and the apoptotic death of the human
neuroblastoma SH-SY5Y cells. Although GQD reduced the levels of nitric oxide (NO) after SNP
treatment, NO scavengers only slightly reduced the cytoprotective effect of GQD in SH-SY5Y
cells. The results show that NO quenching is not the main cytiprotective mechanism of GQD.
GQD reduced the levels of hydroxyl radical (OH•), superoxide radical (O2-•) and lipid peroxides
detected after the SNP treatment. Treatments with nonselective antioxidants and scavengers of
OH• and iron ion (Fe2+) indicated that GQD protect cells by neutralizing the high levels of OH•
generated in the presence of SNP-released Fe2+ and the intracellular hydrogen peroxide (H2O2).
The cytosolic localisation of GQD is necessary for the protection of SH-SY5Y cells from the
SNP-induced oxidative stress. Also, the combined treatment with GQD and SNP induced
autophagy via Akt/PRAS40/mTOR signalling pathway. The induction of autophagy has been
observed at both transcriptional and post-translational levels. The antioxidative effects of GQD
were not directly related to their ability to induce autophagy, since the treatment with
antioxidants (N-acetylcisteine and DMSO) did not induce autophagy in combination with SNP.
In addition, treatments with pharmacological inhibitors of early (wortmannin and 3-
methyladenine) and late (ammonium chloride) stages of autophagy effectively reduced the
protective effects of GQD.
The results of this dissertation suggest that GQD protect SH-SY5Y cells from the SNP-
induced neurotoxicity by exerting dual, antioxidant and pro-autophagic action. Examining the
effects of GQD on the SNP-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cells could contribute in
elucidating the molecular mechanisms underlying their neuroprotective action. Of particular
importance in this context is to determine the influence of oxidative stress and autophagy
modulation, considering their roles as important regulators of neurotoxicity with therapeutic
potential in neurodegenerative and neuroinflammatory diseases.