Идентификација деривата жучних киселина као лиганада хумане рекомбинантне 3α-хидроксистероид дехидрогеназе типа 3 (3αХСД-3) и структурне основе модулације ензимске активности

Abstract

Хумана 3α-хидроксистероид дехидрогеназа типа 3 (3αХСД-3) је ензим из потпородице АКР1Ц који у присуству кофактора NADPH катализује редукцију алдехидних и кето група различитих ендогених и егзогених супстрата међу којима су стероиди, простагландини и ксенобиотици. За овај ензим је карактеристичан висок афинитет за жучне киселине, које након везивања инхибирају његову активност. Ензим 3αХСД-3 је уплетен у развој различитих болести, укључујући неке форме канцера код којих доводи до развијања отпорности туморских ћелија на хемиотерапију. У овој дисертацији тестирана су једињења из библиотеке деривата жучних киселина: најпре је in vitro претрагом утврђено која једињења имају инхибиторно дејство на 3αХСД-3; потом је мерењем IC50 вредности и инхибиције активности сродног ензима 17βХСД-5 тестирана јачина, односно специфичност инхибиције; на крају је in silico и кристалографским студијама утврђена структурна основа везивања испитиваних једињења за 3αХСД-3 односно 17βХСД-5. За неколико испитиваних једињења је утврђено да се везују у активно место ензима. Везивању доприносе поларне групе лиганада, остварујући нековалентне везе са аминокиселинским остацима из активног места. Истовремено, активно место се малим померајима аминокиселинских остатака прилагођава лиганду. Овакво ,,индуковано” прилагођавање АКР ензима лигандима описано је у радовима неколико истраживачких група. На основу сазнања до којих се дошло у овој дисертацији могуће је дизајнирати нове инхибиторе који би се боље и специфичније везивали за 3αХСД-3, а који би у будућности нашли примену у основној науци, као и у терапији патолошких стања повезаних са нарушеном експресијом 3αХСД-3, укључујући и неке метастатске болести.

Humana 3α-hidroksisteroid dehidrogenaza tipa 3 (3αHSD-3) je enzim iz potporodice AKR1C koji u prisustvu kofaktora NADPH katalizuje redukciju aldehidnih i keto grupa različitih endogenih i egzogenih supstrata među kojima su steroidi, prostaglandini i ksenobiotici. Za ovaj enzim je karakterističan visok afinitet za žučne kiseline, koje nakon vezivanja inhibiraju njegovu aktivnost. Enzim 3αHSD-3 je upleten u razvoj različitih bolesti, uključujući neke forme kancera kod kojih dovodi do razvijanja otpornosti tumorskih ćelija na hemioterapiju. U ovoj disertaciji testirana su jedinjenja iz biblioteke derivata žučnih kiselina: najpre je in vitro pretragom utvrđeno koja jedinjenja imaju inhibitorno dejstvo na 3αHSD-3; potom je merenjem IC50 vrednosti i inhibicije aktivnosti srodnog enzima 17βHSD-5 testirana jačina, odnosno specifičnost inhibicije; na kraju je in silico i kristalografskim studijama utvrđena strukturna osnova vezivanja ispitivanih jedinjenja za 3αHSD-3 odnosno 17βHSD-5. Za nekoliko ispitivanih jedinjenja je utvrđeno da se vezuju u aktivno mesto enzima. Vezivanju doprinose polarne grupe liganada, ostvarujući nekovalentne veze sa aminokiselinskim ostacima iz aktivnog mesta. Istovremeno, aktivno mesto se malim pomerajima aminokiselinskih ostataka prilagođava ligandu. Ovakvo ,,indukovano” prilagođavanje AKR enzima ligandima opisano je u radovima nekoliko istraživačkih grupa. Na osnovu saznanja do kojih se došlo u ovoj disertaciji moguće je dizajnirati nove inhibitore koji bi se bolje i specifičnije vezivali za 3αHSD-3, a koji bi u budućnosti našli primenu u osnovnoj nauci, kao i u terapiji patoloških stanja povezanih sa narušenom ekspresijom 3αHSD-3, uključujući i neke metastatske bolesti.

Human type 3 3α-hydroxysteroid dehydrogenase (3αHSD-3) is a member of the AKR1C subfamily of enzymes. Members of the AKR1C subfamily catalyze thereduction of aldehyde and keto groups of various endogenous and exogenoussubstrates including steroids, prostaglandins, and xenobiotics. AKR1Cenzymes work in an NADPH-dependent manner. A distinctive characteristic of3αHSD-3 is that it binds bile acids, which in return act as inhibitors of itsenzymatic activity. 3αHSD-3 is involved in the development of certainpathological conditions including several types of cancer, where itsoverexpression has been proven to lead to chemotherapy resistance. In thisthesis, a library of bile acid derivatives was put through in vitro screening forchanges in 3αHSD-3 enzymatic activity. For compounds that have showninhibitory potential towards 3αHSD-3, inhibition strength and specificity wereestimated utilizing IC50 measurement and 17βHSD-5 inhibition screening.Finally, in silico and crystallographic data were combined to propose astructural model of binding and inhibition of enzymatic activity. Severalcompounds were found to bind to the 3αHSD-3 active site, and this binding wasfavored by polar contacts between hydrophilic groups of tested compounds andamino acid residues in the active site of the enzyme. Small changes in the position of certain residues were noticed, and these changes improved the fitting of ligands to the active site of 3αHSD-3. This ‘induced fitting’ of ligand to the active site of 3αHSD-3 has been observed by several research groups in the past. Results shown in this dissertation can lead to the synthesis of better inhibitors of 3αHSD-3, which could be used in fundamental science, but might as well lead to the development of new drugs that would serve as adjuvant therapy for the treatment of metastatic diseases and other conditions caused by 3αHSD-3 overexpression.