Optimizacija biosinteze antagonista skladišnih patogena jabuke primenom Streptomyces hygroscopicus

Abstract

Plodovi jabuke su tokom čitave godine prisutni u ishrani beba, dece i odraslih ljudi zbog čega je kvalitet i zdravstevena bezbednost ovih namirnica od izuzetnog značaja. Veliki broj fitopatogenih gljiva su prouzrokovači bolesti jabuka međutim, među značajnim prouzrokovačima bolesti jabuka u skladištima spominju se gljive iz rodova Alternaria i Fusarium. Smatra se da su zdravstveno bezbedni plodovi jabuke pre svega zdravi plodovi, bez prisustva fitopatogenih gljiva i bez ostataka fungicida. Sve veća briga oko primene sintetičkih fungicida zbog njihove toksičnosti, razvoja rezistentnosti patogena na fungicide i štetnih efekata na životnu sredinu i zdravlje ljudi, doveli su do potrebe za pronalaženjem alternative hemijskoj zaštiti, a jedno od mogućih se ogleda upravo u primeni biotehnološkim postupkom proizvedenih agenasa. Budući da su visoki troškovi biotehnološke proizvodnje osnovna prepreka za širu primenu ovih agenasa, optimizacija uslova izvođenja biosinteze predstavlja najvažniji korak ka njenom prevazilaženju. Stoga je kao cilj istraživanja u okviru ove doktorske disertacije definisana optimizacija biosinteze antagonista skladišnih patogena jabuke primenom Streptomyces hygroscopicus na nivou laboratorijskog bioreaktora u pogledu odabira izvora ugljenika i azota i količina izvora ugljenika, azota i fosfora u hranljivoj podlozi za biosintezu željenih antagonističkih agenasa, kao i parametara biosinteze sa posebnim osvrtom na intenzitet primenjene aeracije i mešanja. Analizom dobijenih rezultata zaključeno je da se podloga za kultivaciju S. hygroscopicus koja je sadržala glicerol i pored već prisutnog azota u podlozi nije sadržala dodatni izvor azota, pokazala kao najpogodnija za produkciju željenih antagonističkih agenasa efikasnih protiv izolata vrsta A. alternata i F. avenaceum. Rezultati optimizacije sastava hranljive podloge ukazuju da se primenom definisanih optimalnih vrednosti ispitivanih faktora, koje su: sadržaj glicerola od 20 g/l, sadržaj (NH4)2SO4 od 0,25 g/l i sadržaj K2HPO4 od 1,41 g/l u podlozi za biosintezu antagonista skladišnih patogena jabuke primenom S. hygroscopicus, na osnovu definisanih matematičkih modela predviđaju sledeće vrednosti parametara toka i parametara uspešnosti biosinteze antagonista skladišnih patogena jabuke: rezidualni glicerol od 5,3418 g/l; rezidualni azot od 0,193 g/l; rezidualni fosfati od 0,8601 g/l; prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata A. alternata KA10 od 28,22 mm; prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata A. alternata T1Jg3 od 36,86 mm; prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata F. avenaceum KA12 od 25,54 mm i prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata F. avenaceum KA13 od 26,78 mm. Rezultati dobijeni ispitivanjem uticaja različitog intenziteta aeracije i brzine mešanja na biosintezu antagonista skladišnih patogena jabuke primenom S. hygroscopicus u laboratorijskom bioreaktoru standardnih geometrijskih odnosa ukupne zapremine 3 l ukazuju da se primenom definisanih optimalnih vrednosti ispitivanih faktora, brzine mešanja od 100 o/min, intenziteta aeracije od 1,2 l/l/min i pri trajanju kultivacije od 96 h na osnovu definisanih matematičkih modela predviđaju sledeće vrednosti parametara toka i parametara uspešnosti biosinteze antagonista skladišnih patogena jabuke: rezidualni glicerol od 8,2645 g/l; rezidualni azot od 0,1723 g/l; rezidualni fosfati od 0,5167 g/l; suva materija 1,5023 g/l; prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata A. alternata KA10 od 62,62 mm; prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata A. alternata T1Jg3 od 61,09 mm; prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata F. avenaceum KA12 od 45,55 mm i prečnik zone inhibicije rasta micelije izolata F. avenaceum KA13 od 43,02 mm. Validnost dobijenih rezultata potvrđena je izvođenjem biosinteze antagonista skladišnih patogena jabuke na podlozi optimalnog sastava i primenom optimalnih procesnih parametara u laboratorijskom bioreaktoru standardnih geometrijskih odnosa ukupne zapremine 7l, a efikasnost produkovanih antagonističkih agenasa efikasnih na izolate A. alternata (KA10 i T1Jg3) i F. avenaceum (KA12 i KA13) potvrđena je i u in planta ogledima. Ostavreni rezultati optimizacije biosinteze antagonista skladišnih patogena jabuke primenom Streptomyces hygroscopicus na nivou laboratorijskog bioreaktora predstavljaju osnovu za dalje uvećanje razmera do industrijskih, što je ključni korak ka potencijalnoj industrijalizaciji predloženog proizvodnog postupka.

Apple fruits are available on the market all year round and their safety is of great importance for the consumers. Unfortunately, many phytopathogenic fungi can cause apple diseases but fungi from the genera Alternaria and Fusarium are listed among important storage pathogens of apple fruits. It is considered that health-safe apple fruits are primarily healthy fruits, without the presence of phytopathogenic fungi and without the remains of fungicides. Excessive use of pesticides in modern agriculture, including those used for control of fungal phytopathogens, has led to several problems related to pollution, environmental degradation and emergence of resistant strains. Biological control of plant pathogens by means of microorganisms is considered as an attractive alternative to chemical-based treatments, with minimal impact on the environment. The main lack of biotechnology production of the antifungal agents are the high costs, so the optimization of the biosynthesis conditions is the most important step towards its overcoming. Therefore, the aim of this research is to optimize the medium composition and process conditions (agitation and aeration rate) of the antagonists of storage apple pathogens biosinthesis by Streptomyces hygroscopicus in laboratory-scale bioreactor. Based on the obtained results, it can be concluded that the S. hygroscopicus cultivation medium containing glycerol as a carbon source, with no additional nitrogen source, proved to be the most suitable for the production of the A. alternate and F. avenaceum antagonistic agents. The results of the optimization of medium for biosynthesis of the antagonists of storage apple pathogens using S. hygroscopicus indicated the following optimal values of the examined factors: the content of glycerol of 20 g/l, (NH4)2SO4 of 0.25 g/l and K2HPO4 of 1.41 g/l. By applying the defined optimal values and using the appropriate mathematical models, the following responses are predicted: residual glycerol of 5.3418 g/l; residual nitrogen of 0.193 g/l; residual phosphates of 0.8601 g/l; inhibition zone diameters of A. alternata KA10 of 28.22 mm; inhibition zone diameters of A. alternata T1Jg3 of 36.86 mm; inhibition zone diameters of F. avenaceum KA12 of 25.54 mm and inhibition zone diameters of F. avenaceum KA13 of 26.78 mm. Examining the effect of different agitation and aeration rate on the biosynthesis of antagonists of storage apple pathogens using S. hygroscopicus in a laboratory-scale bioreactor with total volume of 3 l, the following optimal values of the investigated factors are obtained: the agitation rate of 100 rpm, the aeration of 1.2 l/l/min and 96-hour as optimal time of cultivation. Bringing together the appropriate mathematical models and defined optimal values, the following responses are predicted: residual glycerol of 8.2645 g/l; residual nitrogen of 0.1723 g/l; residual phosphates of 0.5167 g/l; biomass content of 1.5023 g/l; inhibition zone diameters of A. alternata KA10 of 62.62 mm; inhibition zone diameters of A. alternata T1Jg3 of 61.09 mm; inhibition zone diameters of F. avenaceum KA12 of 45.55 mm and inhibition zone diameters of F. avenaceum KA13 of 43.02 mm. The validity of the results was confirmed by performing the biosynthesis of the antagonists of storage apple pathogens in the medium with optimal composition and the optimal process parameters in a laboratory-scale bioreactor with the total volume of 7l. The efficacy of produced antagonistic agents effective against A. alternata (KA10 and T1Jg3) and F. avenaceum (KA12 and KA13) isolates was confirmed in vitro and in planta. The results obtained within this research represents the basis for the further enlargement of the scale, which is a key step towards the potential industrialization of the proposed production process.