Налаз карактеристичних патоморфолошких промена код оваца инфицираних вирусом катаралне грознице

Abstract

Вирус катаралне грознице оваца наноси велике штете сточарској производњи због чега су правовремено препознавање болести и брза дијагноза есенцијални предуслови за адекватну реакцију ветеринарске службе. Из тих разлога, предмет ове докторске дисертације су анализе патолошких и хистолошких промена код животиња, серолошких и молекуларних метода потребних за идентификацију и ближу карактеризацију узрочника што је од примарног значаја за ефективност предузетих мера у борби против катаралне грознице оваца. Серолошки, током активног надзора, пргледано је 944 узорка крвног серума оваца и 953 узорка крвног серума говеда, а потом, током пасивног надзора, 114 узорака крвног серума говеда, 302 узорка крвног серума оваца и 22 узорка крвног серума коза. Коришћена је компетитивна имуноензимска ELISA метода, којом је доказано присуство специфичних антитела код говеда, оваца и коза. Из пуне крви серопозитивних јединки, ланчаном реакцијом полимеразе уз коришћење Pan-BTV rRT-PCR протокола заснованог на публикацији Toussiant и сар., (2007) је доказано присуство секвенце вирусне РНК. У случају позитивних резултата спроведена је и конвенционална PCR метода, употребом One step PCR кита, уз коришћење два пара прајмера за серотип BTV-4 чиме је доказано да је овај серотип узрочник обољења у Црној Гори. Секвенцирањем и филогенетском анализом изолата утврђено је да припада западном топотипу BTV-4 и да је сродан, готово идентичан са изолатима земаља из окружења. Од 302 овце, којима је узета крв за серолошку анализу, уочене су каратеристичне макроскопске и микроскопске промене код свих угинулих од катаралне грознице оваца. Испитивањем је обухваћено 20 угинулих оваца које су претходно, током испитивања за живота, поред манифестне клиничке слике, имале позитивне резултате серолошких и молекуларних испитивања. Након угинућа, овце су обдуковане при чему су констатоване и сликане макроскопске промене те издвојена ткива за хистолошке анализе. Ткива су фиксирана у 10% пуферизованом неутралном формалину, а потом уклапљена у парафин. Парафински исечци дебљине 5 микрометара су бојени хематоксилин-еозин методом. На промењеним органима доминирају едем, хиперемија и крварења. Хистолошки се запажају интензивне хеморагичне инфилтрације свих промењених органа, а поред тога и местимични некротични процеси у срцу и језику као и периваскуларни едеми лимфних органа са израженом лимфоцитном деплецијом у лимфним чворовима, слезини и тимусу.

Virus kataralne groznice ovaca nanosi velike štete stočarskoj proizvodnji zbog čega su pravovremeno prepoznavanje bolesti i brza dijagnoza esencijalni preduslovi za adekvatnu reakciju veterinarske službe. Iz tih razloga, predmet ove doktorske disertacije su analize patoloških i histoloških promena kod životinja, seroloških i molekularnih metoda potrebnih za identifikaciju i bližu karakterizaciju uzročnika što je od primarnog značaja za efektivnost preduzetih mera u borbi protiv kataralne groznice ovaca. Serološki, tokom aktivnog nadzora, prgledano je 944 uzorka krvnog seruma ovaca i 953 uzorka krvnog seruma goveda, a potom, tokom pasivnog nadzora, 114 uzoraka krvnog seruma goveda, 302 uzorka krvnog seruma ovaca i 22 uzorka krvnog seruma koza. Korišćena je kompetitivna imunoenzimska ELISA metoda, kojom je dokazano prisustvo specifičnih antitela kod goveda, ovaca i koza. Iz pune krvi seropozitivnih jedinki, lančanom reakcijom polimeraze uz korišćenje Pan-BTV rRT-PCR protokola zasnovanog na publikaciji Toussiant i sar., (2007) je dokazano prisustvo sekvence virusne RNK. U slučaju pozitivnih rezultata sprovedena je i konvencionalna PCR metoda, upotrebom One step PCR kita, uz korišćenje dva para prajmera za serotip BTV-4 čime je dokazano da je ovaj serotip uzročnik oboljenja u Crnoj Gori. Sekvenciranjem i filogenetskom analizom izolata utvrđeno je da pripada zapadnom topotipu BTV-4 i da je srodan, gotovo identičan sa izolatima zemalja iz okruženja. Od 302 ovce, kojima je uzeta krv za serološku analizu, uočene su karateristične makroskopske i mikroskopske promene kod svih uginulih od kataralne groznice ovaca. Ispitivanjem je obuhvaćeno 20 uginulih ovaca koje su prethodno, tokom ispitivanja za života, pored manifestne kliničke slike, imale pozitivne rezultate seroloških i molekularnih ispitivanja. Nakon uginuća, ovce su obdukovane pri čemu su konstatovane i slikane makroskopske promene te izdvojena tkiva za histološke analize. Tkiva su fiksirana u 10% puferizovanom neutralnom formalinu, a potom uklapljena u parafin. Parafinski isečci debljine 5 mikrometara su bojeni hematoksilin-eozin metodom. Na promenjenim organima dominiraju edem, hiperemija i krvarenja. Histološki se zapažaju intenzivne hemoragične infiltracije svih promenjenih organa, a pored toga i mestimični nekrotični procesi u srcu i jeziku kao i perivaskularni edemi limfnih organa sa izraženom limfocitnom deplecijom u limfnim čvorovima, slezini i timusu.

The Bluetongue virus (BTV) incurs great damage to the production of livestock, due to which timely recognition of the resultant disease and rapid diagnosis are essential prerequisites for an adequate reaction by the veterinary service. For these reasons, the subject of this doctoral dissertation are the analyses of pathological and histological alterations in animals, the serological and molecular methods necessary for identifying and closely characterizing the causative agent which is of primary concern for the efficacy of the measures taken in the fight against bluetongue disease. Serologically, during active surveillance, 944 samples of sheep blood serum as well as 953 samples of cattle blood serum were examined, followed by 114 samples of cattle, 302 samples of sheep and 22 samples of goat blood serum during passive surveillance. Competitive ELISA was utilized to detect the presence of specific antibodies in cattle, sheep and goats. The presence of viral RNA sequences was confirmed in whole blood samples of seropositive individuals using the Pan-BTV rRT-PCR protocol as described in Toussiant et al. (2007). In the case of positive results conventional PCR analysis was also performed, using the One Step PCR kit with two primer pairs specific to the BTV- serotype, which showed that this serotype is the cause of the disease in Montenegro. Sequencing and phylogenetic analysis of the isolate determined that it belongs to the western topotype of BTV-4 and that it is related and practically identical to the isolates from neighbouring countries. This work describes the macroscopic and microscopic changes found in sheep which died due to affliction with bluetongue disease. The study investigated a sample of 20 sheep for which premortem analysis, apart from the manifested clinical features, had confirmed positive serologic and molecular test results. The animals were dissected postmortem during which macroscopic alterations were identified and imaged, followed by tissue isolation for histological analysis. Tissues were fixed in 10% neutral buffered formalin and embedded in paraffin. Sections of 5μm thickness were cut and stained with haematoxylin/eosin. The predominant organ changes identified included edema, hyperaemia and bleeding. Histologically intensive hemorrhagic infiltrations of all affected organs were observed as well as sporadic necrotic processes in the heart and tongue accompanied by perivascular edemas of the lymphoid organs with pronounced lymphocyte depletion within the lymph nodes, spleen and thymus.