Molekularna karakterizacija sojeva virusa Parainfluence 3 goveda izolovanih na teritoriji Republike Srbije

Abstract

Glavni cilj ove doktorske disertacije je da se izvrši identifikacija i molekularna karakterizacija izolovanih sojeva virusa parainfluence 3 (PI3) goveda sa teritorije Republike Srbije. Izvršena ispitivanja su obuhvatila izolaciju virusa parainfluence 3 iz nosnih briseva goveda na kulturi tkiva i identifikaciju izolovanih sojeva virusa metodom virusneutralizacije, direktne imunofluorescencije i njihovu molekularnu karakterizaciju metodom lanĉane reakcije polimeraze (RT PCR) uz korišćenje prajmera za konzervisane regione HN i F gena virusa PI3 goveda sa sekvenciranjem radi njihove genotipizacije i svrstavanja na filogenetsko stablo izolovanih sojeva pomenutog patogena. Filogenetska analiza izolovanih sojeva izvršena je na osnovu utvrĊivanja homologije i poreĊenja pozicije njihovih nukleotidnih sekvenci sa sekvencama registrovanih sojeva virusa u bazi gena. Na osnovu nukleotidne homologije i pozicije domaćih izolovanih sojeva virusa na filogenetskom stablu, izvršena je njihova genotipizacija. U navedenim ispitivanjima je korišćen referentni soj SF4 virusa PI3 goveda (izolovan u drţavi Tenesi ,SAD). Nazalni brisevi poreklom od 119 goveda razliĉitih rasnih i starosnih kategorija sa ispoljenim simptomima infekcije gornjih partija respiratornog trakta su ispitivani na prisustvo virusa PI3 metodom izolacije na ćelijskoj liniji MDBK (Madin Darby Bovine Kidney). Izolacija virusa vršena je posle najviše tri pasaţe suspektnog materijala na navedenoj ćelijskoj liniji do pojave citopatogenog efekta. Citopatogeni efekat je ustanovljen u ćelijskim linijama posle inokulacije 11 uzoraka ispitivanog materijala, dok je primenom metode virusneutralizacije i direktne imunofluorescencije ustanovljeno prisustvo virusa parainfluece 3 kod 6 inokulisanih ćelijskih linija. U ostalim ćelijskim linijama, pojedinaĉno inokulisanim sa po 5 uzoraka poreklom od ispitivanih nosnih briseva goveda nije dokazano prisustvo virusa parainfluence 3 primenom prethodno navedenih metoda...

The main objective of this doctoral thesis was the identification and molecular characterization of isolated strains of parainfluenza 3 (PI3) from cattle on the territory of the Republic of Serbia. The investigations included isolation of parainfluenza 3 virus from nasal swabs from cattle in tissue culture and identification of isolated strains of the virus by method of virusneutralisation, direct imunoflurescense and their molecular caracterisation by method of polymerase chain reaction (RT-PCR) using primers from conserved regions of the HN and F genes of the virus PI3 cattle, with sequencing and genotyping of domestic strains by help of their inclusion on the phylogenetic tree of mentioned pathogens. Phylogenetic analysis of the isolated strains was carried out on the basis of determination of the homology of the nucleotide sequences with the sequences of strains of the virus registered in gene base NCBI . Genotyping of domestic strains was done on the basis of nucleotide homology and position of local isolated virus strains on the phylogenetic tree, of PI3 virus. In these experiments, reference strain SF4 of virus PI3 of cattle was used (isolated in Tennessee, USA). Nasal swabs originating from 119 cattle with symptoms of infection in upper parts of the respiratory tract were examined for the presence of the virus PI3 by method of isolation of virus on cell line MDBK (Madin Darby Bovine Kidney). Virus isolation was done after three passages of suspected material on cell line till the appearance of cytopathic effect. Cytopathic effect was detected in cell lines after inoculation of 11 tested samples, while applying the method of virusneutralisation and direct immunofluorescense, identification of the virus parainfluece 3 were conformed in 6 inoculated cell lines, but not confirmed in other 5 tested samples from nasal swabs of cattle...