Fenotipska i genotipska karakterizacija bakterija Burkholderia cepacia kompleksa izolovanih kod pacijenata sa cističnom fibrozom

Abstract

Uvod: Oštećenje respiratornog trakta usled hronične mikrobne kolonizacije i infekcije je glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta kod bolesnika sa cističnom fibrozom (CF). Procenjuje se da preko 80% osoba sa CF umire direktno ili indirektno od plućne bolesti. Burkholderia cepacia kompleks (Bck) čini jednu od najvažnijih grupa mikroorganizama koji uzrokuju infekciju u plućima obolelih od CF, praćenu neizvesnom prognozom i značajnim potencijalom za interhumani prenos. Infekcija respiratornog trakta izazvana Bck bakterijama može da perzistira mesecima ili godinama ili da bude udružena sa akutnom bolešću koja ugrožava život. Otkako su opisani prvi slučajevi tokom kasnih 1970-ih i ranih 1980-ih godina, prevalencija Bck infekcija u populaciji bolesnika sa CF je varirala između različitih zemalja i različitih centara za lečenje CF. Usled epidemijskog širenja infekcije, prevalencija je dostizala i 30%, na primer u Češkoj i Velikoj Britaniji. Visokotransmisivne i virulentne klonalne linije koje su izazivale epidemije pripadale su vrsti B. cenocepacia, a najrasprostranjeniji klonovi su ET12 (ST28), CZ1 (ST32), PHDC i Midwest. Iako je većina vrsta u okviru Bck potencijalno sposobna da izazove infekcije kod bolesnika sa CF, B. cenocepacia i B. multivorans su značajno zastupljenije od ostalih vrsta i zajedno su odgovorne za oko 70% svih Bck infekcija kod bolesnika sa CF. Od ranih 2000-ih godina, epidemiologija Bck se promenila u mnogim zapadnoevropskim zemljama, Kanadi i Sjedinjenim Američkim Državama, i prevalencija Bck kolonizacije sada iznosi između 1,4% i 6%, što je rezultat efikasnih mera prevencije. Međutim, podaci o prevalenciji i epidemiologiji Bck bakterija u zemljama Balkanskog poluostrva su oskudni. Ciljevi rada: Cilj ove studije je bio da se ispitaju prevalencija, epidemiološke karakteristike, prisustvo molekularnih markera udruženih sa virulencijom i transmisivnošću, osetljivost na antimikrobne lekove i sposobnost stvaranja biofilma kod izolata Bck bakterija u Centru za cističnu fibrozu Instituta za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije „Dr Vukan Čupić“, koji je i nacionalni referentni centar za ovu bolest. Materijal i metode: Izolati Bck bakterija sakupljeni tokom četvorogodišnjeg perioda trajanja studije (2010.–2013.) su analizirani PCR metodom za amplifikaciju gena za 16S rRNK, recA PCR metodom, elektroforezom na gelu u pulsirajućem polju (PFGE) genomske DNK, metodom tipizacije sekvenciranjem više lokusa (multilocus sequence typing, MLST), i filogenetskom analizom na osnovu konkatenata sekvenci sedam alela korišćenih u MLST analizi...

Introduction: The respiratory tract impairment due to chronic microbial colonization and infection is a major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. It is estimated that over 80% of individuals with CF die directly or indirectly from pulmonary disease. The Burkholderia cepacia complex (Bcc) is one of the most important groups of organisms causing infection in the CF lung, associated with a dubious prognosis and patient-to-patient transmissibility. Respiratory tract infection may persist for months or years or be associated with acute life-threatening illness. Since the first cases were described in the late 1970s and early 1980s, the reported prevalence of Bcc in CF population varied between different countries and CF care centres reaching up to 30%, e.g. in the Czech Republic and the United Kingdom due to the epidemic spread. The highly transmissible and virulent clonal lineages associated with outbreaks belong to B. cenocepacia, and the most successful are ET12 (ST28), CZ1 (ST32), PHDC and Midwest clones. Although most species within Bcc are potentially capable of causing infections in CF patients, B. cenocepacia and B. multivorans are significantly more common than the remaining species and together they account for around 70% of all Bcc infections in the course of CF. Since the early 2000s the epidemiology of the Bcc has changed. In many Western European countries as well as in Canada and the United States, overall Bcc prevalence rates decreased and now range from 1.4% to around 6% as a result of effective prevention strategies. Notwithstanding, data regarding prevalence and epidemiology of Bcc in countries on the Balkan Peninsula is scarce. Objectives: The aim of this study was to evaluate the prevalence, epidemiological characteristics, presence of molecular markers associated with virulence and transmissibility, antimicrobial susceptibility and biofilm formation capacity of the Bcc strains in the National Cystic Fibrosis Centre which is located at the Mother and Child Health Care Institute of Serbia “Dr. Vukan Cupic”, a university-affiliated tertiary care paediatric hospital in Belgrade. Materials and methods: The Bcc isolates collected during the four-year study period (2010–2013) were further examined by 16s rRNA gene, recA PCR, pulsed-field gel electrophoresis of genomic DNA, multilocus sequence typing analysis, and phylogenetic analysis based on concatenated sequence of seven alleles. Selected isolates, previously characterized with respect to the species status and the genotype, were tested for their susceptibility to seven antimicrobials using the E-test method. PCR screenings of eight genetic determinants (cblA, BCESM, cepI, cepR, fliG, llpE, wbiI, bcscV) associated with virulence were performed on genomic DNA extracted from the 14 isolates representative of all genotypes.