Ispitivanje imunomodulatornih efekata alfakalcidola kod pacijenata sa aktivnim reumatoidnim artritisom

Abstract

Poslednjih godina, otkriće ekspresije vitamin-D receptora (VDR) u ćelijama imunskog sistema i činjenica da neke od ovih ćelija i produkuju D hormon, govore u prilog postojanja imunomodulatorne uloge vitamina D u organizmu. Sintetski analog hormona D, alfakalcidol, se koristi u prevenciji i lečenju osteoporoze ali nekoliko studija ukazalo je na njegov mogući terapijski potencijal i u reumatoidnom artritisu. U cilju proučavanja delovanja alfakalcidola primenjeni su komplementarni in vivo, in vitro i ex vivo pristupi koji su podrazumevali ispitivanje imunomodulatornih efekata alfakalcidola kod zdravih kontrola i kod bolesnika sa aktivnim reumatoidnim artritisom (RA). U ispitivanje je, uključeno 16 bolesnika sa RA, oba pola, sa aktivnom bolešću (DAS 28 (SE) >3.2, uprkos terapiji lekovima koji menjaju tok bolesti (LMTB) tokom najmanje mesec dana i 20 zdravih dobrovoljaca (iste distribucije pola i godina starosti) - kontrolna grupa zdravih. Bolesnici sa RA su pored svoje redovne LMTB terapije, dobijali svakodnevno alfakalcidol (2mcg/dan), u trajanju od 12 nedelja. Uzorci periferne krvi su uzimani zdravim kontrolama i bolesnicima pre i posle 12 nedelja terapije alfakalcidolom. Iz uzoraka periferne krvi zdravih kontrola i bolesnika sa RA izolovane su mononuklearne ćelije periferne krvi (MĆPK) koje su kultivisane in vitro. U kulturama MĆPK zdravih kontrola i bolesnika sa aktivnim RA pre terapije alfakalcidolom ispitivan je efekat in vitro suplementacije alfakalcidolom, kalcitriolom, metilprednizolonom i istovremeno alfakalcidol/metilprednizolon suplementacijom na stimulisanu produkciju citokina. Iz supernatanata MĆPK ćelijske kulture određivani su nivoi citokina IL-6, IL-17, IL-21, TNF-α, IL-4, IL-10, TGF-β i IFN-γ ELISA metodom. U kulturama MĆPK izolovanih iz periferne krvi bolesnika sa RA pre i posle dvanaestonedeljne terapije sa alfakalcidolom i zdravih kontrola merena je stimulisana produkcija citokina ELISA metodom i analizirano prisustvo reaktivnih kiseoničnih jedinjenja i potencijal mitohondrijalne membrane limfocita metodom protocne citofluorimetrije. U uzorcima periferne krvi odredjivani su: vrednosti serumskog 25(OH)D metodom elektrohemiluminiscencije, parametri zapaljenja (SE eritrocita i serumska koncentracija C-reaktivnog proteina), parametri aktivnosti bolesti (kompozitni indeks DAS 28), vrednosti serumskih citokina ELISA metodom, parametri oksidativnog stresa (aktivnost antioksidativnih enzima SOD, CAT i GPx kao i nivo MDA u plazmi) spektrofotometrijskom metodom...

The discovery of vitamin D receptor (VDR) expression in the cells of the immune system and the fact that some of these cells produce D hormone indicate immunomodulatory role of vitamin D. Hormone D synthetic analog, alfacalcidol, is used in the prevention and treatment of osteoporosis. Several recent studies pointed to its possible therapeutic potential in rheumatoid arthritis. In order to study alfacalcidol effects, we applied complementary in vivo, in vitro and ex vivo approach that included testing the immunomodulatory effects of alfacalcidol in healthy controls and patients with active rheumatoid arthritis. In sixteen patients with active RA (DAS 28(SE) score >3.2) of both sexes, alphacalcidol (2μg/day) was added to previously applied therapy (stable dose of methotrexate, without any steroid therapy) during three months. Twenty healthy volunteers (same distribution gender and age) were control group. Peripheral blood samples were taken from healthy controls once at the beginning of the study, and from patients before and after 12 weeks of alphacalcidol therapy. Patients and healthy controls peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated and cultured in vitro. In PBMC cultures of healthy controls and patients with active RA, In vitro effects of supplementation with alfacalcidol, calcitriol, methylprednisolone and cotreatment with alfacalcidol/methylprednisolone were studied. Stimulated production of cytokines IL-6, IL-17, IL-21, TNF-α, IL-4, IL-10, TGF-β i IFN-γ were determined by ELISA. In PBMC cultures isolated from peripheral blood of patients with RA before and after twelve weeks of treatment with alfacalcidol and healthy controls, stimulated cytokine production by ELISA was measured and the presence of reactive oxygen compounds and mitochondrial membrane potential of lymphocytes were analyzed by flow cytometry. From the peripheral blood samples were determined: serum 25(OH)D by electrochemiluminiscence method, parameters of inflammation (erythrocyte SE and serum C-reactive protein), the parameters of disease activity (DAS composite index 28), serum cytokines by ELISA method and the parameters of oxidative stress (antioxidant enzymes SOD, CAT and GPx and GSH level in the lysate of erythrocytes and plasma levels of MDA) by spectrophotometric method...