Toksičnost odabranih sojeva cijanobakterija u in vivo i in vitro testovima

Abstract

Cijanobakterije predstavljaju raznovrsnu grupu mikroorganizama poznatih po produkciji visoko potentnih prirodnih toksina koji predstavljaju ozbiljnu pretnju po zdravlje ljudi, životinja i životne sredine. Ovi cijanotoksini se razlikuju po svojoj hemijskoj strukturi i mehanizmu delovanja, a često se u istom okruženju mogu naći različite klase, što čini procenu njihovih toksičnih efekata izazovnom. Kontinuiran razvoj i usavršavanje testova za precizniju detekciju, karakterizaciju i procenu rizika od cijanotoksina je glavni imperativ, te se na globalnom nivou sve češće naglašava potreba za pristupom koji bi omogućio sveobuhvatno proučavanje cijanotoksičnosti i praćenje efekata na različitim biološkim nivoima. U cilju rešavanja ovih izazova, razvijaju se različiti alternativni testovi i primenjuju model organizmi, među kojima su u fokusu u pogledu njihove korisnosti u unapređenju našeg razumevanja ove oblasti, vodeni kičmenjaci i beskičmenjaci. U skladu sa tim, formulisani su primarni ciljevi ove doktorske disertacije koji su podrazumevali procenu akutne toksičnosti ekstrakata odabranih sojeva cijanobakterija in vivo, kod akvatičnih beskičmenjaka (Artemia salina i Daphnia magna) i kičmenjaka (Danio rerio) i identifikovanje faktora koji dovode do modulacije njihove toksičnosti, uključujući dostupnost hranljivih materija, fotoperiod i faze rasta. Dodatno, istraženi su toksični efekti koji se manifestuju na molekularnom nivou dva model organizma, analizom relativnih promena u ekspresiji gena koji reaguju na toksine, kako bi se definisali neki od mehanizama toksičnog delovanja odabranih sojeva. Pored toga, in vitro test bazirani na upotrebi ćelijske linije humanog neuroblastoma je korišćen kako bi se odredio citotoksični i neurotoksični potencijal ispitanih sojeva. Konačno, jedan od osnovnih ciljeva istraživanja je podrazumevao ispitivanje metaboličkog potencijala odabranih sojeva da produkuju određene tipove cijanobakterijskih toksina koristeći imunotest, genomsku i bioinformatičku analizu. U seriji testova akutne toksičnosti, sojevi cijanobakterija su analizirani korišćenjem D. magna, A. salina i D. rerio (zebrica) kao model organizama. Rezultati su pokazali da sojevi cijanobakterija ispoljavaju toksične efekte zavisne od doze i vremena izlaganja, sa varijacijama specifičnim za ispitani soj. U testovima sa modelom D. magna, utvrđena je otpornost ovih organizama prema intracelularnim ekstraktima većine sojeva, izuzev soja Microcystis aeruginosa PCC 7806, koji je pokazao određeni nivo toksičnosti, uzrokujući manje od 25% smrtnosti nakon 48 sati izlaganja. U analizi ekspresije gena koristeći jedinke D. magna kao model organizme, utvrđeno je da su geni povezani sa detoksikacijom, rastom i reprodukcijom reagovali na izlaganje cijanobakterijama. Geni poput cyp360A8, gst i p-gp su se pokazali kao osetljivi indikatori toksičnosti cijanobakterija, pokazujući promene zavisne od primenjene doze ekstrakata. Takođe su detektovane značajne promene u ekspresiji gena cyp314, što implicira potencijalan efekat na procese presvlačenja i rasta kod ovih organizama. Testiranjem toksičnosti sojeva na model organizmu D. rerio, utvrđeni su različiti subletalni efekti, kao što su morfološke abnormalnosti i izmenjene stope izleganja. Specifični efekti su varirali u zavisnosti od ispitivanog soja, trajanja izlaganja i koncentracije ekstrakta. U analizi ekspresije gena kod model organizma D. rerio, uočene su značajne promene u ekspresiji gena povezanih sa metabolizmom ksenobiotika (ahr2 i cyp1A1) i stres endoplazmatskog retikuluma (bip). Najznačajnije promene su utvrđene kod gena abcb4, koji je bio značajno indukovan nakon izlaganja sojevima cijanobakterija, što ukazuje na aktivaciju mehanizma multiksenobiotske rezistencije. Slični efekti primećeni kod D. magna ukazuju na zajednički mehanizam za metabolizam toksičnih cijanobakterijskih jedinjenja kod oba model organizma. U testovima sa vrstom A. salina utvrđena je toksičnost svih cijanobakterijskih sojeva, pri čemu su vodeni sojevi (M. aeruginosa PCC 7806, Oscillatoria DTD-Bečej, Oscillatoria K3 i Oscillatoria Z1) pokazali ukupno najveću toksičnost. Dodatno, otkrivena je pozitivna korelacija između koncentracije azota i toksičnosti sojeva, i povećana toksičnost većine sojeva nakon gajenja u azotom bogatijem okruženju. Optimalni nivoi fosfora su stimulisali toksičnost većine sojeva do praga od 0.04 g L-1, iznad kojeg nisu primećene značajne promene. Takođe je ispitan uticaj trajanja izlaganja svetlosti na toksičnost cijanobakterija, uz uočene sličnosti u odgovoru sojeva koji pripadaju istom rodu cijanobakterija na produženo izlaganje svetlosti tokom kultivacije. Dobijeni rezultati uticaja faze rasta na toksičnost naglašavaju značajan efekat faze rasta na produkciju toksičnih metabolita testiranih sojeva. Utvrđeno je da je najveća toksičnost zabeležena u ekstraktima većine sojeva dobijenih tokom stacionarne faze rasta (nakon 21 i 35 dana kultivacije). U slučaju sojeva roda Oscillatoria registrovano je značajno progresivno povećanje toksičnosti i tokom faze eksponencijalnog rasta i nakon ulaska u stacionarnu fazu, što ukazuje na kontinuiranu proizvodnju toksičnih jedinjenja tokom svih faza rasta. Nakon ispitivanja efektata cijanobakterijskih ekstrakata na ćelije humanog neuroblastoma, utvrđena je dozno-zavisna citotoksičnost kod većine sojeva. Varijabilnost u odgovoru ćelija primećena je pri produženom izlaganju specifičnim sojevima, što ukazuje na različite sastave ekstrakata i njihov efekat na ovaj tip ćelija. Nakon upotrebe enzimskog testa (ELISA) u detekciji ekvivalenata mikrocistina (MC-LR) u ekstraktima cijanobakterija, utvrđena je veoma niska koncentracija za većinu sojeva. Ovaj rezultat sugeriše da mikrocistini i nodularini nisu primarno odgovorni za uočenu toksičnost u primenjenim biološkim testovima. Značajan doprinos ove doktorske disertacije ogleda se u formiranju kolekcije sekvenci genoma autohtonih vodenih i zemljišnih sojeva cijanobakterija izolovanih sa područja Republike Srbije, predstavljajući prva takva istraživanja na ovim prostorima. S obzirom na to da na svetskom nivou postoji stalna potreba za dopunjavanjem genomskih baza cijanobakterija novim sekvencama, rezultati ovih istraživanja će značajno doprineti dostupnosti novih 9 sekvenciranih genoma koji pripadaju rodovima Anabaena, Nostoc i Oscillatoria. Genomskom analizom cijanobakterijskih sojeva je otkrivena izuzetna raznolikost metaboličkih puteva, sa specifičnim klasterima gena odgovornim za proizvodnju različitih toksičnih jedinjenja. Klasteri gena za biosintezu mikrocistina otkriveni su isključivo u genomu terestričnog soja Nostoc LC1B, u skladu sa rezultatima ELISA testova. U genomima vodenih sojeva Oscillatoria K3 i Oscillatoria Z1 identifikovani su klasteri gena za proizvodnju citotoksina cilindrospermopsina sa značajnom pokrivenošću. Kod ostalih ispitanih sojeva su detektovani klasteri gena za proizvodnju specifičnih toksičnih jedinjenja, kao što su anabenopeptin, mikroviridin J, mikroviridin N9, jamajkamid A, scitociklamid A, nostoklid N9, hektoklorin i puvainaficin F. U cilju dokazivanja produkcije i identifikacije takvih toksičnih metabolita i dubljeg razumevanja njihove aktivnosti, neophodna su dalja ispitivanja i primena proteomskih i metabolomskih analiza.

Cyanobacteria are a diverse group of organisms known for producing highly potent cyanotoxins which pose significant threats to human, animal, and environmental health. These toxins have diverse chemical structures and toxicity mechanisms and several toxin classes can be present simultaneously, making it difficult to assess their toxic effects using physico-chemical methods. Continued development and refinement of assays is necessary for their improved detection, characterization, and risk assessment and emphasizes the need for a multi-level approach to studying cyanotoxicity. To address these challenges, alternative tests and model organisms among aquatic vertebrates and invertebrates are continually explored for their utility in advancing our understanding of this field. The primary objectives of this doctoral dissertation were to evaluate the acute toxicity of extracts of selected cyanobacterial strains in vivo, in aquatic invertebrate (Artemia salina and Daphnia magna) and vertebrate (Danio rerio) organisms and identify factors that lead to modulation of their toxicity, including nutrient availability, light period and growth phase. Furthermore, the study aimed to explore the toxic effects manifesting at the molecular level by analyzing the relative changes in the expression of toxin-responsive genes, in order to define some of the mechanisms of toxic action of the selected strains. Additionally, in vitro tests using a human neuroblastoma cell line were utilized to determine their cytotoxic and neurotoxic potential. Lastly, the research aimed to examine the potential of selected strains to produce the best studied groups of cyanobacterial toxins using an immunoassay and various bioinformatics tools. In a series of acute toxicity tests, cyanobacteria strains were evaluated using Daphnia magna, Artemia salina, and Danio rerio (zebrafish) as model organisms. The results showed that cyanobacterial strains exhibited dose- and time-dependent toxic effects, with variations specific to the strain. D. magna proved resistant to most strains, except for Microcystis aeruginosa PCC 7806, which exhibited mild toxicity, causing less than 25% mortality after 48 hours of exposure. In contrast, D. rerio displayed strain-dependent sublethal effects, such as morphological abnormalities and altered hatching rates. The specific effects varied based on the strain, exposure duration, and concentration. In the gene expression analysis using D. magna as the model organism, the study revealed that genes related to detoxification, growth, and reproduction responded to cyanobacterial exposure. Genes like cyp360A8, gst, and p-gp were sensitive indicators of cyanobacterial toxicity, displaying dose dependent changes. The study also noted significant shifts in the cyp314 gene expression, implying potential impacts on molting and growth processes, warranting further investigation. In the analysis of gene expression in Danio rerio (zebrafish), significant changes were observed in genes related to xenobiotic metabolism (ahr2, cyp1A1) and endoplasmic reticulum stress (bip). Notably, the abcb4 gene was prominently induced after exposure to specific cyanobacterial strains, indicating the activation of a multixenobiotic resistance mechanism. Similar effects observed in D. magna suggested a shared mechanism for metabolizing toxic cyanobacterial compounds in both model organisms. The A. salina tests indicated toxicity in all cyanobacterial strains, with aquatic strains, including M. aeruginosa PCC 7806, Oscillatoria DTD Bečej, Oscillatoria K3, and Oscillatoria Z1, exhibiting the highest toxicity. Furthermore, the study investigated the relationship between cyanobacterial growth conditions and toxicity. It revealed a positive correlation between nitrogen concentration and strain toxicity, particularly in nitrogen-rich environments. Optimal phosphorus levels stimulated toxicity in most strains up to a threshold of 0.04 g L-1, beyond which no significant changes were observed. The influence of light exposure duration on cyanobacterial toxicity was also examined, with observed similarities in the response of strains belonging to the same cyanobacterial genus to prolonged exposure to light during cultivation. The research also emphasized the impact of growth phases on toxicity. It found that the highest toxicity was recorded in extracts of most strains obtained after 21 and 35 days of cultivation, particularly during the stationary growth phase. Interestingly, for strains of the genus Oscillatoria, a significant progressive increase in toxicity was observed during the exponential growth phase and continued after entering the stationary phase, suggesting continuous production of toxic compounds throughout all growth phases. Moreover, the study investigated the effects of cyanobacterial extracts on human neuroblastoma cells, revealing dose-dependent cytotoxicity of most strains. Variability in the response of cells was noted with prolonged exposure to specific strains, indicating different compositions of extracts and their effects on cell types. Тhe study used an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the content of microcystin (MC-LR) equivalents in cyanobacterial extracts, which was found to be very low in most strains. This result suggested that microcystins and nodularins were not primarily responsible for the observed toxicity in the applied bioassays. Lastly, genomic analysis of the cyanobacterial strains uncovered a remarkable diversity of metabolic pathways, with specific gene clusters responsible for the production of various toxic compounds. Gene clusters for microcystin biosynthesis were detected exclusively in the genome of the terrestrial strain Nostoc LC1B, consistent with ELISA results. In the genomes of aquatic strains Oscillatoria K3 and Oscillatoria Z1, gene clusters for the production of the cytotoxin cylindrospermopsin were identified with significant coverage. Furthermore, other strains displayed gene clusters for the production of specific toxic compounds, such as anabenopeptin, microviridin J, microviridin N9, jamajkamid A, scitocyclamide A, nostoclide N9, hectochlorin, and puvainaphicin F. To confirm the production of these identified toxic metabolites and gain a deeper understanding of their activity, further testing and the application of proteomic and metabolomic analysis were deemed necessary. Sequencing the entire genomes of these strains marked a significant contribution to the understanding of cyanobacteria in the Republic of Serbia, representing the first comprehensive research of its kind in the region. The data contributed to the availability of sequenced genomes for genera Anabaena, Nostoc, and Oscillatoria, enhancing our global knowledge of these organisms and their potential impacts on aquatic ecosystems and human health.