Uloga humoralnog imunskog odgovora u etiopatogenezi amiotrofične lateralne skleroze

Abstract

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS) je fatalna neurodegenerativna bolest sa početkom u adultnom dobu koja se karakteriše progresivnim gubitkom gornjih i donjih motoneurona, što dovodi do atrofije muskulature, mišićne paralize i smrti usled slabosti respiratorne muskulature. Oko 5-10% ALS slučajeva su sa familijarnom istorijom bolesti (fALS), dok su preostali slučajevi sporadični (sALS) sa nepoznatim uzrokom bolesti. Cilj ove disertacije bio je da proceni efekat imunoglobulina G (IgG) izolovanog iz sALS bolesnika (ALS IgG) na homeostazu kalcijuma i mobilnost endozoma/lizozoma kod pacovskih kortikalnih astrocita u kulturi. ALS IgG (0.1 mg/ml) poreklom od 7 ALS pacijenata, za razliku od IgG iz 3 kontrolne osobe, izazvao je prolazne promene unutarćelijske koncentracije kalcijuma (Ca2+-talas) u astrocitima. Povećana aktivnost kalcijuma detektovana je kod oko polovine astrocita nakon tretmana sa ALS IgG, bez obzira na prisustvo vanćelijskog kalcijuma (47,5 ± 12,9 %, 2 mM Ca2+ naspram 48,2 ± 13,6 %, 0 mM Ca2+). U prisustvu vanćelijskog kalcijuma, maksimalna vrednost promene dostignuta je ~3x brže (19,7 ± 2,8 s, 2 mM Ca2+ naspram 56,3 ± 6,8 s, 0 mM Ca2+) i ukupno povećanje kalcijuma (površina pod Ca2+-talasom) bilo je ~1.7x veće (26,0 ± 1,6 F/F0 *s, 2 mM Ca2+ naspram 15,6 ± 1.1 F/F0 *s, 0 mM Ca2+), ali vanćelijski kalcijum nije uticao na maksimum amplitude kalcijumovog talasa. Primena farmakoloških inhibitora otkrila je da je aktivacija inozotol 1,4,5-trifosfatnog (IP3), za razliku od rianodinskog receptora neophodna i dovoljna da inicira povećanu aktivnost, a ulazak kalcijuma kroz TRPC kanale produžava odgovor. Inhibicija fosfolipaze C (PLC) umanjuje, dok inhibicija fosfatidilinozitol-3-kinaze (PI3K) u potpunosti sprečava tipičan ALS IgG-izazvan kalcijumski odgovor. Populacija vezikula obeleženih lizotrekerom koji boji endozome i lizozome, sastojala se od stacionarnih vezikula (6,1%) sa prosečnom brzinom koja nije prelazila 67 nm/s i mobilnih vezikula (93.9%) čija je ukupna dužina putanje (TL) pređene za 15 s iznosila u proseku 3,03±0,01 μm. ALS IgG (0.1 mg/ml) poreklom iz 12 od 13 ALS bolesnika povećao je TL mobilnih vezikula za ~24% i maksimalni pomeraj (MD) za ~26% tokom praćenih 4 min, za razliku od kontrolnih IgG (poreklom od 4 osobe) koji nisu uticali na mobilnost vezikula. ALS IgG-izazvano povećanje mobilnosti bilo je manje izraženo u rastvoru bez Ca2+, što ukazuje da su promene u homeostazi kalcijuma uključene u proces kojim ALS IgG povećava mobilnost vezikula. Interesantno, ALS IgG kao i ATP (1 mM) nisu uticali na oslobađanje sadržaja vezikula, što znači da je brza i kompletna egzocitoza malo verovatan događaj kod astrocita u kulturi u našim eksperimentalnim uslovima. Sumarno, ALS IgG utiče na kalcijumovu homeostazu astrocita preko IP3-posredovanog oslobađanja kalcijuma iz endoplazmatičnog retikuluma i ulaska kalcijuma kroz TRPC kanale, uz aktivaciju PI3K uzvodno od PLC. ALS IgG povećavaju mobilnost endozoma i lizozoma, a ovaj efekat delimično zavisi od vanćelijskog kalcijuma. Ova studija je otkrila molekulske mehanizme kojima astrociti postaju meta humoralnog imunskog odgovora u ALS, što može da doprinese etiopatogenezi bolesti.

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is an adult onset fatal neurodegenerative disease characterized mainly by the progressive loss of upper and lower motor neurons resulting in wasting, paresis and death from respiratory failure. Approximately 5-10% of ALS cases are familial (fALS), while the rest are sporadic (sALS) with unknown cause of disease. The objective of this dissertation was to evaluate the effect of immunoglobulin G (IgG) isolated from sALS patients (ALS IgG) on calcium homeostasis and mobility of endosomes/lysosomes in cultured rat cortical astrocytes. ALS IgG (0.1 mg/ml) from 7 ALS patients, but not IgG from 3 control individuals evoked calcium transients (Ca2+-waves) in astrocytes. About half of the tested astrocytes responded with elevated calcium activity regardless of the presence of extracellular calcium (47.5 ± 12.9 %, 2 mM Ca2+ vs. 48.2 ± 13.6 %, 0 mM Ca2+). In presence of extracellular calcium, the peak amplitude developed ~3x faster (19.7 ± 2.8 s, 2 mM Ca2+ vs. 56.3 ± 6.8 s, 0 mM Ca2+) and the overall magnitude of calcium rise (area under the Ca2+-wave) was ~1.7x larger (26.0 ± 1.6 F/F0 *s, 2 mM Ca2+ vs. 15.6 ± 1.1 F/F0 *s, 0 mM Ca2+), while the peak amplitude itself was not affected. Application of pharmacological inhibitors revealed that activation of inositol 1,4,5- triphosphate (IP3), but not of ryanodine receptors is necessary and sufficient to initiate elevated activity, while the influx of extracellular calcium through TRPC channels prolongs the responses. Inhibition of phospholipase C (PLC) diminishes, while the inhibition of phosphatidilinositol-3-kinase (PI3K) completely prevents typical ALS IgG evoked calcium response. The population of vesicles labeled with lysotracker that mainly stains endosomes and lysosomes, consisted of non-mobile (6.1%) vesicles with the average speed of <67 nm/s and mobile vesicles (93.9%) with total track length (TL) in 15 s averaging at 3.03±0.01 μm. ALS IgG (0.1 mg/ml) from 12 of 13 patients increased the TL of mobile vesicles by ~24% and the maximal displacement (MD) by ~26% within 4 min, while IgG from control group (n=4) did not alter the vesicle mobility. The mobility enhancement by ALS IgG was less pronounced in Ca2+-free extracellular solution, indicating that ALS IgG vesicle mobility enhancement involves changes in Ca2+ homeostasis. Interestingly, neither ALS IgG nor ATP (1 mM) triggered the release of vesicular cargo, making rapid and complete exocytosis unlikely in cultured astrocytes in our experimental conditions. In conclusion, ALS IgG affect calcium homeostatic system in astrocytes by IP3 mediated calcium release from the endoplasmic reticulum and entry of extracellular calcium through TRPC channels, with the activation of PI3K upstream of PLC. ALS IgG enhance the mobility of endosomes and lysosomes, and this effect is partialy dependent on extracellular calcium. This study revealed the molecular mechanisms by which astrocytes become targeted cells for humoral immune response in ALS that could contribute to the aetiopathogenesis of the disease.