Efekti i mehanizmi delovanja interleukina-17 na funkcije mezenhimskih i endotelskih ćelija
Effects of interleukin-17 on mesenchymal and endothelial cell functions and mechanisms involved
Докторанд
Kocić, Jelena S.Ментор
Bugarski, DianaЧланови комисије
Korać, AleksandraSantibañez, Juan
Метаподаци
Приказ свих података о дисертацијиСажетак
Interleukin (IL) 17 familija citokina se smatra najmanje istraženom citokinskom
familijom sa značajnom ulogom u procesu inflamacije. Ubikvitarna rasprostranjenost
receptora za IL-17 omogućava ovom citokinu mnogobrojne biološke efekte u
organizmu, poput važne uloge u imunskom odgovoru i regulaciji procesa hematopoeze,
ali i u progresiji različitih bolesti, uključujući inflamatorna, autoimunska i maligna
oboljenja. IL-17 ima ulogu u ćelijskim procesima poput proliferacije i diferencijacije, i
to prvenstveno na hematopoetskim matičnim i progenitor ćelijama, pri čemu IL-17
ispoljava različite efekte na proliferaciju i diferencijaciju zavisno od tipa ćelijske loze i
stepena diferencijacije ćelija. Takoñe, zbog ubikvitarne rasprostranjenosti svog
receptora, IL-17 je uključen u interakcije izmeñu imunskog sistema i somatskih tkiva.
Novija istraživanja su pokazala da IL-17 ima i ulogu finog regulatora diferencijacije
mezenhimskih matičnih ćelija (MSC, Mesenchymal stem cells), s obzirom na to d...a
stimuliše osteogenu diferencijaciju dok, s druge strane, inhibira adipogenu diferencijciju
humanih MSC.
Savremena istraživanja biologije MSC ukazala su na širok opseg njihove potencijalne terapijske primene, prvenstveno u regenerativnoj medicini, jer ove
multipotentne adultne matične ćelije koje predstavljaju nediferencirane ćelije sa
sposobnošću samoobnove, imaju sposobnost diferenciranja u ćelije tkiva mezenhimskog
porekla, poput osteoblasta, hondroblasta i adipocita, a prema saznanjima koja imamo
danas, i u ćelije tkiva ektodermalnog i endodermalnog porekla. Matične ćelije različitog
stepena multipotentnosti izolovane su iz raznih adultnih tkiva, kao i perinatalnih tkiva
koja se poslednjih godina sve češće pominju kao povoljan izvor MSC. Meñutim, i pored
velikog napretka u ovoj oblasti, nema konačnih saznanja kako o mehanizmima
odgovornim za regulaciju višestrukih funkcija MSC, tako i o njihovom ukupnom
terapijskom potencijalu. Kako biološke funkcije MSC umnogome zavise od konteksta mikrosredine, ispitivanje interakcija MSC i IL-17 u održavanju multipotentnosti,
mobilizaciji i usmerenoj diferencijaciji MSC je od posebnog značaja.
Pored mezenhimskih ćelija, IL-17 ostvaruje svoje efekte delovanjem na
endotelske ćelije. Jedan od terapijskih ciljeva u regenerativnoj medicini, koji je još uvek
nedovoljno objašnjen, je i podsticanje revaskularizacije oštećenog tkiva. Stimulacija
postojećih, in situ prisutnih endotelskih ćelija na angiogenezu je jedan od mogućih
mehanizama. Efekti IL-17 na endotelske ćelije nisu do sada u potpunosti opisani, i
poznato je samo da IL-17 u prisustvu drugih poznatih angiogenih faktora stimuliše
sposobnost endotelskih ćelija za angiogenezu. Pored toga, poznato je da se funkcije
ćelija kao i delovanje citokina značajano razlikuju u zavisnosti od procenta kiseonika
prisutnog u mikrosredini ćelija. Efekat delovanja IL-17 na endotelske ćelije u prisustvu
različitih koncentracija kiseonika do sada nije istraživan. Takoñe je još uvek nepoznato
da li IL-17 može uticati na diferencijaciju MSC u endotelske ćelije. Da bi se sprovela
istraživanja u ovom pravcu, neophodno je uspostaviti pogodan model za diferencijaciju
MSC u endotelske ćelije Cilj istraživanja ove disertacije bilo je ispitivanje efekata IL-17 na različite
ćelijske funkcije mezenhimskih i endotelskih ćelija u specifičnim uslovima
mikrosredine. Analizirano je dejstvo IL-17 na proliferaciju, migraciju, angiogenezu i
diferencijaciju ćelija. Istraživani su i molekularni mehanizmi koji omogućavaju finu
regulaciju ćelijskih funkcija od strane IL-17, analizom aktivacije signalnih molekula,
kao i ekspresije gena i proteina neophodnih za specifične funkcije. Posebna pažnja u
istraživanjima bila je posvećena izolaciji, karakterizaciji i endotelskoj diferencijaciji
primarnih MSC iz tkiva pupčanika (UC-MSC, Umbilical cord-mesenchymal stem cells).
U okviru razjašnjavanja efekata i mehanizama delovanja IL-17 na diferencijaciju
mezenhimskih ćelija, primenjena je multipotentna mišja C2C12 ćelijska linija. Uticaj
IL-17 na diferencijaciju analiziran je na osnovu ekspresije gena i proteina specifičnih za
odreñeni tip diferencijacije: teškog lanca miozina (MyHC, Myosin heavy chain) i
miogenina za miogenu, a alkalne fosfataze (ALP, Alkaline phosphatase), Runx2/Cbfa1
(Runt-related transcription factor 2/Core-binding factor subunit alpha-1)
transkripcionog faktora i ciklooksigenaze 2 (Cox-2, Cyclooxygenase 2) za osteogenu
diferencijaciju. Pored toga, utvrñivano je učešće mitogenom aktiviranih protein kinaza
(MAPK) i morfogenetskih proteina kosti (BMP, Bone morphogenic proteins) u IL-17-usmerenoj diferencijaciji C2C12 ćelija. Rezultati su pokazali da IL-17 inhibira miogenu
i stimuliše osteogenu diferencijaciju C2C12 ćelija, s obzirom na to da je IL-17-zavisna
inhibicija miogeneze povezana sa redukcijom ekspresije iRNK za miogenin, redukcijom
ekspresije MyHC i izostankom formiranja miotuba, dok je IL-17-zavisna indukcija
osteogeneze povezana sa indukcijom ekspresije iRNK za Runx2/Cbfa1, indukcijom
ekspresije Cox-2 i povišenom aktivnošću ALP. Rezultati su takoñe pokazali da IL-17
ostvaruje ove efekte putem aktivacije ERK1,2 MAPK signalnog puta, nezavisno od
BMP-Smad signalnog puta.
U drugom delu ove studije ispitivan je efekat IL-17 na funkcije endotelskih
ćelija na modelu humane endotelske ćelijske linije, EA.hy 926, praćenjem njihove
proliferacije, migracije i tubulogeneze u uslovima normoksije i hipoksije. Analizirana je
i ekspresija gena za endotelsku azot monoksid sintazu (eNOS, Endothelial nitric oxide
synthase) i Cox-2, kao i njihovih proteinskih produkata, budući da ovi molekuli imaju
važnu ulogu u procesu angiogeneze. Dobijeni rezultati su potvrdili da IL-17 stimuliše
ključne funkcije uključene u proces angiogeneze EA.hy 926 ćelija, poput ćelijske
migracije i tubulogneze, kao i ekspresiju eNOS i Cox-2 u ovim ćelijama. Pro-angiogeni
efekti IL-17 su pokazani u uslovima normoksije (20% O2). Uslovi hipoksije (3% O2)
pokazali su toksično dejstvo na ovu ćelijsku liniju, dok je IL-17 u ovakvim uslovima
umanjio broj apoptotičnih ćelija. U okviru trećeg dela ove disertacije MSC su izolovane iz vezivnog tkiva
pupčanika, tzv. Vartonove sluzi, umnožene i okarakterisane prema važećim
preporukama i kriterijumima Meñunarodnog društva za ćelijsku terapiju. Zatim je
ispitan i odreñen optimalni protokol za njihovu efikasnu diferencijaciju u endotelske
ćelije, u cilju uspostavljanja novog ćelijskog modela za buduća istraživanja. Princip
diferenciranja UC-MSC u endotelske ćelije zasnivao se na inhibiciji signalizacije
faktora transformacije rasta (TGF-β, Transforming growth factor beta), i to njegovog
receptora, aktivinu-nalik kinaze 5 (ALK5, Activin-like kinase). Na osnovu dobijenih
rezultata, zaključeno je da se UC-MSC odlikuju visokom sposobnošću samoobnove i
visokim kapacitetom za diferencijaciju kao i da se mogu diferencirati u endotelske ćelije
putem inhibicije ALK5 receptora
Interleukin (IL) 17 cytokine family is considered the least explored cytokine
family with an important role in inflammation. Due to the ubiquitous expression of its
receptor, IL-17 has been implicated in interactions between the immune system and
somatic tissues. In this context, recent findings have shown that IL-17 acts as a fine
regulator of mesenchymal stem cell (MSC) differentiation. Having in mind that
behaviour of MSC depends on the surrounding microenvironment, it is important to
analyze the interactions between MSC and IL-17 involved in the maintenance of their
multipotency, mobilization and directed differentiation. In addition to mesenchymal
cells, IL-17 exerts its roles by acting on endothelial cells as well. Even though IL-17’s
effects on endothelial cells have not been fully discovered yet, it is well known that IL-
17, in the presence of other angiogenic factors, has the ability to stimulate endothelial
cells to undergo angiogenesis. Furthermore, it is well known that ce...llular functions, as
well as cytokine effects can be significantly modulated by the percentage of oxygen
present in their microenvironment. However, effects of IL-17 on endothelial cells in the
context of different O2 concentrations have not been explored yet. Also, it is still
unknown whether IL-17 can affect endothelial differentiation of MSC, but to address
this issue, it is necessary to create a valid model of endothelial differentiation of MSC. The objective of this study was to investigate the effects of IL-17 on different
functions of mesenchymal and endothelial cells in specific microenvironmental
conditions. The influence of IL-17 on proliferation, migration, angiogenesis and
differentiation was analyzed, as well as the molecular mechanisms involved. The
activation of various signaling molecules and the expression of genes and proteins
involved in specific functions were examined. Yet another objective was to establish an
appropriate model for the mesenchymal-endothelial transdifferentiation. For this task
primary MSC from umbilical cord tissue (UC-MSC) were isolated and characterized
with emphases on their endothelial differentiation. In order to elucidate the effects and mechanisms involved in IL-17 acting on
mesenchymal cell differentiation, a multipotent mouse C2C12 cell line was used. The
influence of IL-17 on cell differentiation was analyzed based on the expression of genes
and proteins specific for the certain type of differentiation: Myosin heavy chain
(MyHC) and Myogenin for myogenic, and Alkaline phosphatase (ALP), Runt-related
transcription factor 2/Core-binding factor subunit alpha-1 (Runx2/Cbfa1) and
Cyclooxygenase-2 (Cox-2) for osteogenic differentiation. Additionaly, the involvement
of Mitogen-activated protein kinases (MAPK) and Bone morphogenetic proteins (BMP)
in IL-17-directed differentiation of C2C12 cells was investigated. Results obtained
demonstrated that IL-17 inhibits myogenic and stimulates osteogenic differentiation of
C2C12 cells, by down-regulating the Myogenin mRNA expression, MyHC expression
and myotube formation, while up-regulating the Runx2/Cbfa1 mRNK expression, Cox-
2 expression and ALP activity. IL-17 exerted these effects by activating ERK1,2 MAPK
signaling pathway, which in turn regulated the expression of relevant genes and proteins
to inhibit myogenic differentiation and induce osteogenic differentiation. It was also
shown that the induction of osteogenic differentiation by IL-17 is independent of the
BMP-Smad signaling pathway. In the second part of this study the effect of IL-17 on endothelial cell functions
was investigated using human endothelial cell line EA.hy 926 as a model. The changes
in cells’ proliferation, migration and tubulogenesis were analyzed, along with the
expression of genes for endothelial Nitric oxide synthase (eNOS) and Cox-2, and their
corresponding protein products, since these molecules have important roles in
angiogenesis. The influence of the environmental stimuli (normoxia vs. hypoxia) was
also investigated. Results obtained demonstrated that IL-17 stimulates crutial events
involved in angiogenesis of EA.hy 926 cells, such as cell migration and tubulogenesis,
along with the expression of eNOS and Cox-2. However, the effects of IL-17 were
dependent on the O2 concentration, since pro-angiogenic effects of IL-17 were noticed
in the presence of 20% O2, while 3% O2 exerted toxic effect on this cell line, and IL-17
in these conditions decreased the number of apoptotic cells.
In the final task, MSC were isolated from the umbilical cord Wharton’s jelly,
expanded in culture and characterized according to the recomendations from the
International Society for Cell Therapy. Following this, an optimal protocol for the endothelial diffrentiation of UC-MSC was established. The endothelial-directed
differentiation was based on the inhibition of the Transforming growth factor beta
(TGF-β) signaling, specifficaly its receptor activin-like kinase 5 (ALK5). Based on the
results gained, it was concluded that UC-MSC have a high ability to selfrenew and high
diferentiation capacity, as well as that these cells can be differentiated into endothelial
cells by inhibiting ALK5 receptor
Факултет:
Универзитет у Београду, Биолошки факултетДатум одбране:
01-10-2012Пројекти:
- Регенеративни и модулаторни потенцијал адултних матичних ћелија (RS-MESTD-Basic Research (BR or ON)-175062)
- Регенеративни и модулаторни потенцијал адултних матичних ћелија (RS-MESTD-Basic Research (BR or ON)-175062)