Primena mikroskopije X zracima u mapiranju hemijskih elemenata u Mycobacterium avium pks12 mutantu

Abstract

Mycobacterium avium je važan humani intracelulami patogen, koji prvenstveno inficira mononukleame fagocite. Sredinski uslovi unutar fagozoma u kojima se može naći ova mikobakterija, kao što je koncentracija elemenata u tragovima, utiče na ekspresiju mikobakterijskih gena i intracelulamo preživljavanje. Koristeći mikroprobu sa tvrdim X zracima u prethodnom radu su analizirane koncentracije hemijskih elemenata unutar fagozoma C57BL/6 mišijih makrofaga koji su inficirani patogenim mikobakterijskim vrstama - M. tuberculosis i M. avium, odnosno nepatogenom vrstom, M. smegmatis. U fagozomima koji su sadržali patogene mikobakterije, koncentracija gvožđa je rasla tokom vremena, dok je u onim sa nepatogenom M. smegmatis koncentracija gvožđa opadala. Značajna razlika u koncentraciji nekoliko drugih elemenata u fagozomima je zabeležena između patogenih mikobakterija u prvom satu infekcije, kao i izmedu patogenih mikobakterija i M. smegmatis. Ovi rezultati ukazuju na postojanje patogen-specifične mikrosredine u endozomalnom sistemu domaćina. U ovom radu istraživanja su proširena na infekcije U937 ćelijske linije, modela humane mikobakterijemije, sa M. avium wt i M. avium pksl2 mutantom. Gen pks!2 gene je kandidat za gen za virulentnost. Njegov produkt je uključen u sintezu komponente ćelijskog zida. Koncentracija gvožđa u U937 fagozomima nije porasla posle 24 h infekcije, kao što je zabeleženo u C57BL/6 fagozomima. Sa druge strane, u U937 fagozomima koji su sadržali M. avium pksl2 mutant koncentracija gvožđa je statistički značajno opala posle 24 h infekcije. Statistički značajan porast koncentracije kalijuma između prvog i 24. sata infekcije je zabeležen u U937 fagozomima koji su sadržali M. avium wt, za razliku od C57BL/6 fagozoma. Slično povećanje koncentracije kalijuma u toku infekcije je zabeleženo u U937 fagozomima sa M. avium pksl2 mutantom. Razmatrana je mogućnost da su kalijumski kanali prisutni na fagozomima makrofaga i da mogu biti povezani sa baktericidnim dejstvom, slično neophodnom prisustvu kalijumskih kanala za baktericidnu funkciju neutrofila. Takode je traženo postojanje razlika između C57BL/6 i U937 fagozoma, kao i između U937 fagozoma koji su sadržali M. avium wt, odnosno M. avium pks!2 mutant, koje bi mogle ukazati na ulogu produkta pksl2 gena u virulenciji. Ovaj rad ukazuje na značaj korišćenja mikroprobe sa tvrdim X zracima u proučavanju patogenih mikobakterijskih infekcija i podržava procenu da bi buduće studije sa tehnički poboljšanom mikroprobom sa tvrdim X zracima omogućile bolje razumevanje virulentnosti infektivnih patogena.

Mycobacterium avium is important human intracellular pathogen that infects primarily mononuc lear phagocytes. The environment of the mycobacteria inside the phagosome, such as the concentration of trace elements, is likely to influence mycobacterial gene expression and intracellular survival. In previous work, using hard X-ray microprobe, it has been analyzed the elemental concentrations inside the phagosomes of C57BL/6 mouse macrophages infected with pathogenic mycobacterial species - M. tuberculosis and M. avium, or the apathogenic M. smeg}?iatis. In phagosomes infected with pathogenic mycobacteria, the iron concentration increased over the time, while in those of avirulent M. smegmatis, the iron decreased. Significant difference in the phagosomal concentration of several other elements was observed between pathogenic mycobacteria after the first hour of infection, as well as some elements showed different phagosomal concentrations between pathogenic mycobacteria and M. smegmatis. The results indicate pathogen-specific microenvironments within the host cell's endosomal system. In this work studies were expanded to M. avium wt- and M. avium pksl2 mutant- infections of U937 cell line, a model for human bacteremia. The pksl2 gene is a candidate for virulence gene. Its product is involved in synthesis of cell wall component. The iron concentration in U937 phagosomes didn't increase after 24 hours of infection with M avium wt, as was in C57BL/6 phagosomes. On the other hand, U937 phagosomes-containing M. avium pksl2 mutant showed a significant decrease of iron concentration after 24 hours of infection. A significant increase of potassium concentration was observed in U937 phagosomes-containing M. avium wt between 1 and 24 hours, in contrast with macrophages from C57BL/6 mice. Similar increase of potassium during a course of infection was observed in U937 phagosomes-containing M. avium pksl2 mutant. It was hypothezised that a potassium channel is abudant in the phagosome in macrophage that may be related to microbiocidal killing, similar to the requirement of potassium channels for microbiocidal function in neutrophils. It was also sought to determine whether there were differences between C57BL/6 and U937 phagosomes, as well as between U937 phagosomes containing either M. avium wt or M. avium pksl2 mutant, which could indicate the role in virulence of pksl2 gene product. These studies show the importance of the use of a hard X-ray microprobe for the study of pathogenic bacterial infections, and support the assessment that future studies with technically improved hard X-ray microprobe will allow a better understanding of the virulence of infectious pathogen.