Анализа експресије eNOS и ангиогених фактора HIF-1alfa и VEGF у мијелопролиферативним неоплазмама: веза са присуством мутација у генима за JAK2 i CALR

Abstract

Мијелопролиферативне неоплазме (МПН) представљају клоналне болести матичних ћелија хематопоезе које карактерише поремећај пролиферације једне или више мијелоидних ћелијских линија. МПН обухватају 3 ентитета: полицитемију веру (ПВ), есенцијалну тромбоцитемију (ЕТ) и примарну мијелофиброзу (ПМФ). Најзаступљенији поремећај код МПН је JAK2V617F мутација која је присутна код 97% пацијената са дијагнозом ПВ и 50-60% пацијената са дијагнозама ЕТ и ПМФ. JAK2V617F мутација индукује конститутивну активацију нисходних сигналних путева (JAK2/STAT3, PI3K/АКТ, MAPK) који су укључени у мијелопролиферацију. Друга најзаступљенија соматска мутација, која је присутна код већине JAK2V617F негативних ЕТ и ПМФ пацијената, повезана је са геном који кодира калретикулин (CALR) присутна код 31,9% ЕТ и 31,7% ПМФ пацијената. Код различитих хематолошких малигнитета, укључујући и МПН, као одраз појачане ангиогенезе, описано је присуство повишене експресије фактора раста васкуларног ендотела (VEGF). У новијим истраживањима показана је веза између експресије VEGF гена и нивоа хипоксија-индуцибилног фактора-1 (HIF-1) азот моноксида (NО). Неколико студија до сада је показало да NО може индуковати продукцију VEGF путем PI3K/Akt/PKB/HIF-1α пута, али и да делује као инхибитор HIF-1α експресије. Циљ истраживања ове дисертације било је испитивање степена експресије и корелација кључних ангиогених фактора - HIF-1α, VEGF и ендотелне NО синтазе (eNOS) у костној сржи, CD34+ ћелијама и гранулоцитима МПН пацијената према JAK2 и CALR статусу и терапији. Поред тога, користили смо проинфламаторни IL-6 да индукујемо експресију HIF-1α, VEGF и eNOS у хуманој HEL 92.1.7 ћелијској линији са JAK2 мутацијом, као и у диферентованим макрофагама. Такође испитивано је учешће различитих сигналних путева (ЈАК2/STAT3, PI3К/Аkt, MAPK) путем којих IL-6 остварује своје ефекте, на моделу HEL ћелијске линије као и код гранулоцита МПН пацијената. Резултати ове студије су показали да ангиогени фактори имају израженију експресију у гранулоцитима него у CD34+ и ћелијама костне сржи, што указује на значај инфламаторних гранулоцита у развоју ангиогенезе. Показана је и значајна негативна корелација између протеинске експресије HIF-1α и VEGF, као и HIF-1α и еNOS, док између VEGF и eNOS постоји значајна позитивна корелација код гранулоцита МПН пацијената. Стандардно лечење применом хидроксиуреје код МПН пацијената има антиангиогени потенцијал у смислу смањења сва три ангиогена фактора – HIF-1α, VEGF и eNOS у гранулоцитима...

hematopoiesis characterized by a disorder of proliferation of one or more myeloid cell lines. MPNs include 3 entities: polycythemia (PV), essential thrombocythemia (ET), and primary myelofibrosis (PMF). The most common disorder in MPN is the JAK2V617F mutation present in 97% of patients diagnosed with PV and 50-60% of patients with ET and PMF diagnoses. The JAK2V617F mutation induces the constituent activation of the innate signal pathways (JAK2 / STAT3, PI3K / AKT, MAPK) involved in myeloproliferation. The second most common somatic mutation, which is present in most JAK2V617F negative ET and PMF patients, is associated with the calreteculin (CALR) encoding genome present in 31.9% ET and 31.7% of PMF patients. In the case of various hematological malignancies, including MPN, as a reflection of increased angiogenesis, the presence of elevated expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) has been described. Recent studies have shown the relationship between the expression of the VEGF gene and the levels of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) and nitrogen monoxide (NO). Several studies have so far shown that NO can induce the production of VEGF via PI3K / Akt / PKB / HIF-1α times, but also acts as an inhibitor of HIF-1α expression. The aim of the study was to investigate the degree of expression and correlation of key angiogenic factors - HIF-1α, VEGF and endothelial NO synthase (eNOS) in the bone marrow, CD34+ cells and granulocytes of MPN patients according to JAK2 and CALR status and therapy. In addition, we used proinflammatory IL-6 to induce the expression of HIF-1α, VEGF and eNOS in the human HEL 92.1.7 cell line with a JAK2 mutation, as well as in differentiated macrophages. Also studied was the participation of various signaling pathways (JAK2 / STAT3, PI3K / Akt, MAPK) through which IL-6 achieved its effects on the HEL cell line model as well as in granulocyte of MPN patients. The results of this study have shown that angiogenic factors have a more pronounced expression in granulocytes than in CD34+ and bone marrow cells, which indicates the importance of inflammatory granulocytes in the development of angiogenesis. A significant negative correlation between HIF-1α and VEGF protein expression, as well as HIF-1α and eNOS, was shown, while there was a significant positive correlation between VEGF and eNOS in granulocytes of MPN patients. Standard treatment with hydroxyurea in MPN patients has antiangiogenic potential in terms of reducing all three angiogenic factors - HIF-1α, VEGF and eNOS in granulocytes...