Show simple item record

Analyses of expression, activity and localization of the new type of aspartic proteinase (FeAPL1) from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench)

dc.contributor.advisorMaksimović, Vesna R.
dc.contributor.otherRadović, Svetlana
dc.contributor.otherFira, Đorđe
dc.creatorMilisavljević, Mira
dc.date.accessioned2019-02-08T15:49:21Z
dc.date.available2019-02-08T15:49:21Z
dc.date.issued2009-12-04
dc.identifier.urihttp://eteze.bg.ac.rs/application/showtheses?thesesId=6591
dc.identifier.urihttps://fedorabg.bg.ac.rs/fedora/get/o:19383/bdef:Content/download
dc.identifier.urihttp://vbs.rs/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=70036&RID=36672783
dc.identifier.urihttp://nardus.mpn.gov.rs/123456789/10731
dc.description.abstractIz biblioteke cDNK semena heljde u srednjoj fazi sazrevanja prethodno je izolovana cDNK koja kodira atipičnu aspartičnu proteinazu (FeAPL1), a zatim i odgovarajući genomski fragment koji, osim kodirajuće sekvence, sadrži i 5’-regulatorni region u kome su uočeni cis-elementi koji mogu učestvovati u regulaciji ekspresije ovog gena pod uticajem faktora spoljašnje sredine i opredeljivati njegovu seme-specifičnu ekspresiju. U ovom radu uradjena je detaljna analiza ekspresije gena FeAPL1 po organima heljde- na nivou RNK upotrebom metoda RT-PCR i Real Time RT-PCR, a analizom Western blot na nivou proteina. Umnošci slabog intenziteta su uočeni u fazama sazrevanja semena do stadijuma 14 DAF, za kojima sledi naglo povećanje količine transkripta u stadijumu 14-17 DAF, nakon čega dolazi do smanjenja količine RNK. Profil ekspresije proteina prati profil ekspresije RNK. U listu, korenu, stablu i cvetu uočene su male količine transkripta, ali odgovarajući protein nije bio prisutan. Kako je kompjuterskom analizom predikovano više cis-aktivirajućih elemenata u promotorskom regionu gena za FeAPL1, njegova ekspresija je praćena i pod uticajem stresogenih faktora spoljašnje sredine (UV zračenje, mrak, mehanička povreda, suša, salicilna kiselina), ali značajne promene u ekspresiji nisu oučene ni u jednom ispitivanom slučaju. U cilju dobijanja proteina u količini pogodnoj za biohemijsku analizu i produkciju antitela, korišćeno je nekoliko ekspresionih sistema: E. coli, P. pastoris i kultura insekatskih ćelija. Zadovoljavajuća ekspresija dobijena je jedino pri upotrebi konstrukta rMBP-FeAPL1 u soju Rosetta-gami E. coli u kome je dobijen solubilan rekombinantni fuzioni proteina koji, nakon proteolitičke obrade, poseduje enzimsku aktivnost na pH 3,0, inhibiranu pepstatinom A. Rekombinantni protein, rFeAPL1-His6, od ~55 kDa, je eksprimiran u ćelijskoj liniji duvana BY-2 u kome je detektovana pepstatin A senzitivna enzimska aktivnost na pH 3,0 bez prethodne proteolitičke obrade. Veća molekulska masa u odnosu na predikovanu (46 kDa) ukazuje na verovatnu glikozilaciju proteina. Imunocitohemijskom analizom i analizom proteina protoplasta transformisanih BY-2 ćelija je utvrđeno da je FeAPL1 lokalizovan u ćelijskom zidu. Na osnovu dobijenih rezultata diskutovane su potencijalne funkcije proteinaze FeAPL1.sr
dc.formatapplication/pdf
dc.languagesr
dc.publisherУниверзитет у Београду, Биолошки факултетsr
dc.rightsAutorstvo-Nekomercijalno-Bez prerade 3.0 Srbija (CC BY-NC-ND 3.0)
dc.sourceУниверзитет у Београдуsr
dc.titleAnaliza ekspresije, aktivnosti i lokalizacije FeAPL1- novog tipa asparatične proteinaze heljde -Fagopyrum esculentum Moench-sr
dc.title.alternativeAnalyses of expression, activity and localization of the new type of aspartic proteinase (FeAPL1) from buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench)en
dc.typePhD thesis


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record