Promene strukture DNK izazvane proteinom HsOrc4

Abstract

У ћелијама свих живих организама репликација ДНК се одвија у неколико сложених и међусобно веома сличних фаза, а започиње тек када иницијаторни протеински комплекс препозна специфичне секвенце у геному. И поред великог биолошког значаја процеса репликације мало се зна о механизмима који регулишу иницицијацију синтезе ДНК вишећелијских еукариота. Ори секвенце ових организама не садрже консензус секвенце, али су богате АТ базним паровима груписаним у кратке, наизменичне или хомогене низове. Овакви елементи могу да формирају алтернативне структуре, а оне могу бити значајне за интеракцију ори секвенци и иницијаторног комплекса, или могу настати током интеракције иницијационог комплекса и ДНК и бити значајне за наредне фазе иницијације. У овом раду су испитиване интеракције рекомбинантног протеина HsOrc4 са фрагментом изолованим из хуманог репликатора LMNB2 и различитим синтетским ДНК које саджре А и Т елементе. Протеин је изабран за анализу јер чини део комплекса ORC (eng. Origin Recognition Complex), показује самосталну везивну активност и припада фамилији ААА+ суперфамилије макромолекулских шаперона. У раду је потврђено да се HsOrc4 преференцијално везује за ДНК богату АТ базним паровима и ТАТ елементима, и показано да стимулише некакнонску ренатурацију комплементарних фрагмената у специфичну троланчану структуру. Такође је показано да овај протеин стимулише и формирање ТАТ триплекса од одговарајућих олигонуклеотида. У раду је описана и сасвим неочекивана способност протеина да катализује асоцијацију хомоаденинских олигонуклеотида у раније непознате дволанчане и, вероватно, четвороланчане структуре. Хомоаденинске структуре биле су зависне од магнезијумових јона, термостабилне и повезане Хугстиновим везама. Судећи према деловању мутираних форми протеинa HsOrc4 неактивних у везивању или хидролизи АТР-а, за каталитичку активност HsOrc4 неопходно је везивање, али не и хидролиза АТР-а. Будући да је основна улога иницијационог комплекса да ремоделује ори секвенцу и припреми је за наредне фазе иницијације, описано деловање протеина HsOrc4 могло би да допринесе формирању комплексне архитектуре ори репликације и да има значајну улогу у иницијацији репликације.

In multicellular eukaryotes DNA replication initiates at fixed chromosomal sites called origins of replication (ori). They host initiation start sites and binding sites for universal eukaryotic initiator called origin recognition complex (ORC), but do not share conserved consensus sequences. All origins are AT rich and contain homopurine/homopyrimidine stretches that can form alternative DNA structures, potentially important for origin function. In order to understand alternative structures of origins and the manner in which specific proteins influence DNA structure, we have investigated interactions of recombinant protein HsOrc4 with various origin or synthetic DNAs. HsOrc4 was chosen as DNA-binding component of ORC and a member of the AAA+ superfamily of macromolecular chaperones. HsOrc4 preferentially recognized double-stranded and triple-stranded AT rich DNA and stimulated renaturation of the origin fragment lboI into specific triple stranded structure, or renaturation of complementary oligonucleotides into intermolecular TAT triplex. An unexpected feature of HsOrc4 shown in our study was its ability to catalyse self-association of adenines creating homoadenine duplexes and possibly quadruplexes. The action of HsOrc4 was dependant on the presence of magnesium ions and ATP. ATP had a role as a cofactor, because HsOrc4 did not require its hydrolysis for activity. The mutated form HsOrc4 WA, which could not bind ATP, was inactive in restructuring reactions, whereas mutated form HsOrc4 WB, unable to hydrolyse ATP, showed similar activity to the wild type HsOrc4. Ability to form Hoogsteen bonds was essential for substrates in restructuring reactions, as these bonds held newly formed structures together. Substrates containing 7-Deaza-ATP, dATP analogue unable to form Hoogsteen bonds, were inactive in these assays. The features of HsOrc4 shown in this study are potentially biologically important, because its action could expand structural repertoire of genomes by producing energetically unfavourable DNA structures. These structures may be involved in determination of origin specificity.